豬鏈球菌2型假定外膜蛋白Omp40及Ⅳ分泌系統(tǒng)VirB4蛋白免疫原性鑒定.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）是一種重要的人畜共患病病原體，能引起豬疫病，臨床上能引起豬的高熱、腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等，同時(shí)對(duì)畜牧業(yè)從業(yè)人員帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅，可以導(dǎo)致人的腦膜炎及中毒性休克綜合癥等嚴(yán)重疾病。根據(jù)其莢膜多糖抗原性的差異，可分為35個(gè)血清型（1-34，1/2）。其中2型流行最廣、致病性最強(qiáng)且危害最嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)以豬鏈球菌2型為研究對(duì)象，對(duì)新發(fā)現(xiàn)的可能的毒力因子Omp40和VirB4進(jìn)行免疫原性

2、研究，為今后亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1豬鏈球菌2型假定外膜蛋白Omp40及Ⅳ分泌系統(tǒng)VirB4蛋白的表達(dá)
　　 Omp40及VirB4蛋白是根據(jù)SS2毒力菌株HA9801與無(wú)毒力菌株T15抑制性差減雜交得到的可能的毒力因子，根據(jù)已發(fā)表的豬鏈球菌2型（S.suis type2）人源98HAH33株的Omp40及VirB4蛋白的基因序列，分析選擇免疫原性較好部分的基因序列設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物，以HA9801株的基因組

3、DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出蛋白的部分基因并定向克隆至表達(dá)載體pET-32a（+）中。重組質(zhì)粒通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3），表達(dá)出分子量約為52.5 kDa、56.4 kDa的融合蛋白，Western-blot顯示，其與豬源ZY05719株康復(fù)血清有良好的免疫反應(yīng)性。
　　 2假定外膜蛋白Omp40及Ⅳ分泌系統(tǒng)VirB4蛋白對(duì)ICR小鼠免疫試驗(yàn)
　　 分別表達(dá)了豬鏈球菌2型HA9801

4、株Omp40和VirB4兩種蛋白，用表達(dá)的蛋白作為免疫原，分別或等量混合來(lái)免疫ICR小鼠，定時(shí)采血，對(duì)免疫小鼠的血清抗體水平用間接ELISA進(jìn)行分析；并通過(guò)熒光定量PCR方法來(lái)檢測(cè)IL-4和IFN-γ，表達(dá)水平。分析表明小鼠二免后14d抗體達(dá)到最高水平；Omp40免疫組的各項(xiàng)免疫學(xué)參數(shù)與空白對(duì)照組差異顯著（P>0.05）；VirB4免疫組的各項(xiàng)免疫學(xué)參數(shù)差異不顯著（P<0.05）；Omp40和VirB4等量免疫組中IL-4差異顯著（P>

5、0.05），IFN-γ差異不顯著（P<0.05）。
　　 3假定外膜蛋白Omp40及Ⅳ分泌系統(tǒng)VirB4蛋白對(duì)斑馬魚(yú)的免疫保護(hù)力評(píng)價(jià)
　　 350尾野生斑馬魚(yú)，隨機(jī)分成五組，第一、二、三組分別用已純化的Omp40蛋白、VirB4蛋白及兩種蛋白等量混合免疫，第四、五組作為對(duì)照組分別以豬鏈球菌2型HA9801株全菌滅活苗和滅菌PBS免疫。首免14d后用同樣劑量加強(qiáng)免疫一次，二免后第14d用50LD50HA9801（LD50=