豬鏈球菌2型烈性及溶原性噬菌體的分離與鑒定.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)是一種重要的人畜共患病病原,根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的不同,分為35個(gè)血清型(1-34型,1/2型)。世界范圍內(nèi)以豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)流行最廣,致病性最強(qiáng)。國(guó)內(nèi)1991年在廣東省首次分離鑒定到SS2,隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)暴發(fā)人感染SS2并致人死亡,危害嚴(yán)重。SS2感染已成為影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要問(wèn)題之

2、一。分離和鑒定SS2的噬菌體,研究SS2的噬菌體對(duì)此類革蘭氏陽(yáng)性菌的遺傳進(jìn)化和環(huán)境生態(tài)學(xué)有重要的理論意義及實(shí)用價(jià)值。然而,目前對(duì)豬鏈球菌的噬菌體國(guó)內(nèi)外迄今研究甚少,僅有一篇關(guān)于SS2溶源性噬菌體的報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)SS2同時(shí)進(jìn)行了烈性和溶原性噬菌體的研究。 從健康巴馬香豬的鼻拭子樣本中分離出一株SS2的烈性噬菌體,命名為SMP,并從形態(tài)學(xué)和分子水平對(duì)其特性進(jìn)行研究。噬菌體SMP顆粒在電鏡下觀察,頭部呈正六邊形,直徑約50nm,尾部約

3、135nm,無(wú)非伸縮性,屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。噬菌體SMP的宿主范圍較窄,僅能裂解被測(cè)的24株SS2中的2株。SMF對(duì)熱比較敏感,40℃以上的高溫處理后活力明顯下降,60℃處理后活力完全消失。SMP在pH6-10范圍內(nèi)比較穩(wěn)定,在pH6.0以下失活較快。SMP的核酸屬于雙股線性DNA,可以被BglII、EcoRI、NcoI、BamHI和PstI消化,而不能被NotI消化。一步生長(zhǎng)曲線表明潛伏期為20min,生長(zhǎng)期為120min,平均裂解量為

4、77 PFU/cell。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了從健康豬體內(nèi)分離到SS2烈性噬菌體,這將為豬鏈球菌病的治療開(kāi)辟新的途徑。 用甘油梯度離心純化噬菌體SMP顆粒,提取噬菌體基因組DNA,建立shot-gun隨機(jī)文庫(kù),從文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行測(cè)序并完成序列組裝,對(duì)SS2烈性噬菌體SMP進(jìn)行基因組測(cè)序。通過(guò)限制性內(nèi)切酶圖譜分析,并結(jié)合酶切片段的變性、復(fù)性實(shí)驗(yàn)分析基因組末端。預(yù)測(cè)可能存在的開(kāi)放讀碼框(ORF),對(duì)噬菌體的相關(guān)基因作進(jìn)化樹(shù)分析。測(cè)序

5、結(jié)果表明噬菌體SMP基因組是36,216 bp大小的線性dsDNA分子,其堿基組成為A=31.72％[11487];G=23.24％[8418];T=26.67％[9659];C=18.37％[6652];稀有堿基對(duì)為0[0];A+T=58.39％[21146];C+G=41.61％[15070]。預(yù)測(cè)的169個(gè)大于150bp的ORFs中,48個(gè)被推定為編碼的基因,大多數(shù)與已報(bào)道的噬菌體序列同源,包括頭蛋白、末端酶大亞單位、復(fù)制蛋白、單

6、股結(jié)合蛋白和主要的尾蛋白等。形態(tài)學(xué)特征和基因組序列的測(cè)定與分析表明,SMP在分類上屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。噬菌體SMP的基因組序列的測(cè)定與分析,將為功能基因組學(xué)、溶原性機(jī)理、溶原性/裂性轉(zhuǎn)換及有效誘導(dǎo)手段的研究、比較基因組學(xué)、噬菌體與宿主菌相互作用關(guān)系、噬菌體介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移(尤其是致病基因、耐藥基因)、生物多樣性、噬菌體工程改造和噬菌體治療等方面提供重要的線索。 為了研究噬菌體整合酶基因在SS2中的分布情況,根據(jù)噬菌體整合酶基因設(shè)計(jì)

7、引物,建立了PCR方法,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示,255株SS2致病菌株均擴(kuò)增出目的片段,非毒力株T15、5株其它血清型豬鏈球菌及蘭氏C群豬源鏈球菌未擴(kuò)增出目的片段。經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo)后,25株SS2致病菌株均出現(xiàn)完全的細(xì)胞溶解,而非毒力株T15未出現(xiàn)溶解。電鏡下觀察SS2致病株HA9801和ZY05719誘導(dǎo)產(chǎn)生的溶原性噬菌體,頭部呈正六邊形,無(wú)尾部。經(jīng)DNase I等處理,鑒定其核酸類型為dsDNA。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和核酸性質(zhì),推