豬鏈球菌噬菌體穿孔素(holin)的亞細(xì)胞定位及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu).pdf

1、豬鏈球菌病是一種重要的人獸共患傳染病，可以引起腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等疾病。近年來由于抗生素濫用等原因，菌株對(duì)抗生素呈現(xiàn)嚴(yán)重耐藥和多重耐藥，給該病的防控帶來了困難。探索新的治療方法尤為迫切，其中基于噬菌體的治療策略再次引起關(guān)注。
　　噬菌體治療技術(shù)的關(guān)鍵在于細(xì)菌裂解作用，現(xiàn)有研究認(rèn)為:噬菌體裂菌的生物化學(xué)基礎(chǔ)是其編碼的“穿孔素(holin)-裂解酶(lysin)”系統(tǒng)。而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)豬鏈球菌噬菌體裂菌機(jī)制的研究較為鮮見。

2、為此在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究噬菌體穿孔素的亞細(xì)胞定位、膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及不同位點(diǎn)氨基酸對(duì)穿孔素定時(shí)裂菌功能的影響，研究結(jié)果對(duì)深入揭示基于穿孔素的裂菌機(jī)制具有重要意義。
　　為了確定穿孔素的亞細(xì)胞定位情況，選擇綠色熒光蛋白作為示蹤分子。首先把gfp基因插入到pET-32a(+)載體中，構(gòu)建質(zhì)粒p32G。然后利用DNA重組技術(shù)將gfp基因與holin基因的N-端通過不同長(zhǎng)度的linker進(jìn)行連接，獲得單一的融合基因表達(dá)載體p

3、32GH。將構(gòu)建的質(zhì)粒p32G和p32GH分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細(xì)胞，陽(yáng)性重組菌加入DiI染料培養(yǎng)，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后采用共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示只表達(dá)GFP的菌株，其綠色熒光彌散分布于整個(gè)細(xì)胞;而gfp與holin基因融合表達(dá)的菌株，綠色熒光則集中分布于細(xì)胞膜上。上述結(jié)果表明穿孔素holin定位于細(xì)菌細(xì)胞膜上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度的linker對(duì)穿孔素的定時(shí)裂解功能影響很大。
　　為了揭示穿孔素holin的膜

4、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，采用半胱氨酸定點(diǎn)突變掃描技術(shù)(SCAM)解析了穿孔素上的關(guān)鍵氨基酸在膜內(nèi)外的分布情況。在綜合三種膜蛋白預(yù)測(cè)軟件解析結(jié)果的基礎(chǔ)上，在穿孔素不同的區(qū)域各選擇一個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼?，重組突變菌株用巰基試劑MPB進(jìn)行原位標(biāo)記，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示這七個(gè)突變菌株，雖然只改變了一個(gè)氨基酸，但對(duì)其功能影響卻很大。通過分析這七個(gè)突變菌株，發(fā)現(xiàn)G35C、T80C、Y105C三

5、個(gè)位點(diǎn)分布在細(xì)胞膜內(nèi)，分別參與形成三個(gè)跨膜區(qū)，與基于生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。
　　為了進(jìn)一步研究基于穿孔素蛋白的裂菌機(jī)制以及每個(gè)跨膜區(qū)之間氨基酸的相互作用。在穿孔素蛋白編碼序列已知的基礎(chǔ)上，選擇不同位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行突變，從而改變編碼的單個(gè)氨基酸，重組突變菌株與野生菌株相比僅改變了穿孔素上的一個(gè)氨基酸，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)的基因突變對(duì)穿孔素蛋白功能影響比較顯著。同一個(gè)氨基酸突變?yōu)椴煌陌被?，?duì)生長(zhǎng)曲線并沒有規(guī)律

6、性的影響。但不同位點(diǎn)的甲硫氨酸全部突變?yōu)榱涟彼?，生長(zhǎng)曲線卻有顯著差異。而且，每個(gè)突變菌株與全長(zhǎng)穿孔素重組菌pEXH1相比，裂菌時(shí)間均有變化，表明穿孔素蛋白的裂菌功能對(duì)其編碼序列十分敏感。
　　綜上可見，豬鏈球菌噬菌體的穿孔素holin定位于細(xì)胞膜;屬于Ⅰ型穿孔素蛋白，具有三個(gè)跨膜區(qū)，蛋白N-端和C-端均位于細(xì)胞膜外側(cè);穿孔素蛋白的功能對(duì)其編碼序列十分敏感，尤其是跨膜區(qū)序列。通過對(duì)穿孔素蛋白膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的初步解析，將為深入揭示穿孔素觸