豬鏈球菌溶原性噬菌體裂解酶Ly7917的挖掘與生物活性研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種人畜共患病原菌，臨床分離株大多呈現(xiàn)對(duì)抗生素嚴(yán)重耐藥和多重耐藥，應(yīng)用抗生素治療豬鏈球菌感染面臨巨大挑戰(zhàn)，而基于噬菌體的抗菌策略再現(xiàn)潛力。噬菌體的裂菌功效依賴(lài)于侵染后期合成的細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶——裂解酶（endolysin），近年來(lái)，裂解酶也成為研發(fā)新型抗菌制劑的熱點(diǎn)。眾所周知，大多數(shù)病原菌存在前噬菌體（prophage），其基因組上一般含有裂解酶基因。故本文通過(guò)對(duì)GenBank中已完成全基因組測(cè)序的數(shù)株豬鏈球菌前噬菌體基因信息

2、分析，挖掘出一個(gè)由豬鏈球菌7型菌株前噬菌體編碼的裂解酶，進(jìn)而系統(tǒng)研究了其生物學(xué)活性、發(fā)現(xiàn)了與裂菌活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)并初步探索了嵌合裂解酶的研制方法。
　　為了實(shí)現(xiàn)裂解酶的高效表達(dá)，本研究以豬鏈球菌7型菌株7917基因組為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得裂解酶基因ly7917，將其克隆至質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度和時(shí)間等誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了大量的Ly7917。
　　為了

3、揭示Ly7917的生物學(xué)活性，基于平板裂解試驗(yàn)測(cè)定了Ly7917的裂菌譜，結(jié)果顯示，該裂解酶對(duì)15株豬鏈球菌（包括2型、7型和9型）、39株金黃色葡萄球菌（包括18株MRSA菌株）和1株馬鏈球菌獸疫亞種參考株均具有裂解作用；基于濁度遞減試驗(yàn)測(cè)定了Ly7917對(duì)不同菌株的裂解效率，結(jié)果表明，Ly7917對(duì)14株豬鏈球菌和1株馬鏈球菌的裂解效率高，對(duì)沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌不具有裂解作用；裂解酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH研究表明，

4、Ly7917在22-37℃范圍內(nèi)裂解活性均較高，在酸性（pH4.5）和堿性（pH8.5）環(huán)境下仍能夠高效裂解高致病性豬鏈球菌菌株HA9801；Ly7917在4℃儲(chǔ)存的穩(wěn)定性研究表明，4℃放置1個(gè)月，活性單位由211降為28；凍融對(duì)裂解酶活性影響的研究表明，-80℃與室溫反復(fù)凍融10次后，活性單位由211降為29，而1次凍融則對(duì)裂解酶的活性沒(méi)有影響。
　　為了揭示Ly7917上與裂菌活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，本研究參考NCBI上報(bào)道

5、的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶CHAP催化域的晶體結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)了10個(gè)可能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，并分別進(jìn)行定點(diǎn)突變、表達(dá)及活性檢測(cè)。結(jié)果表明，Ly7917上的第26位半胱氨酸、102位組氨酸和118位谷氨酸均為維持Ly7917裂菌活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。
　　為了拓寬Ly7917的裂菌譜，本研究通過(guò)融合PCR技術(shù)，將ly7917與李斯特菌噬菌體裂解酶plyw001結(jié)合域cbd連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體ly7917-cbd-pET28a(+)和c

6、bd-ly7917-pET28a(+)，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)嵌合裂解酶Ly7917-CBD和CBD-Ly7917，平板裂解試驗(yàn)表明Ly7917-CBD和CBD-Ly7917均能夠裂解HA9801，但不能裂解李斯特菌HA1073。
　　綜上所述，本文通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，可溶性高效表達(dá)裂解酶Ly7917，且其裂菌譜廣，為裂解酶的臨床抗菌應(yīng)用提供了可能；Ly7917穩(wěn)定性好、對(duì)外界環(huán)境耐受能力強(qiáng)，便于儲(chǔ)存及運(yùn)輸；通過(guò)定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)