豬鏈球菌2型表面精氨酸肽酶的鑒定與其功能的研究.pdf

1、豬鏈球菌是新生的重要的人畜共患病原菌，感染人類和豬后會(huì)出現(xiàn)敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等癥狀。至今為止，據(jù)有文獻(xiàn)記錄報(bào)道，豬鏈球菌已造成全球20多個(gè)國家超過1584例人類感染。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌共計(jì)可分為33種血清型，而其中2型是臨床病例分離中最為常見的血清型，其次是14型，其他類型血清型如1型、4型、5型、16型和24型也均有報(bào)道。近年來雖然學(xué)術(shù)界對(duì)S.suis的感染關(guān)注度日益加大，然而對(duì)于豬鏈球菌致病機(jī)理，尤其是誘

2、發(fā)腦膜炎以及中毒樣休克綜合征的潛在機(jī)制，知之甚少。
　　鑒于病原菌蛋白酶在降解宿主組織、逃避和干擾宿主免疫系統(tǒng)等多方面的重要效能，在本研究中，我們重點(diǎn)關(guān)注豬鏈球菌精氨酸蛋白酶的鑒定工作，以及探討其在豬鏈球菌感染過程中所起的作用。淀粉酶結(jié)合蛋白B(Abpb)是本室早期鑒定到的重要的免疫原性蛋白，通過生物信息分析，顯示其假想的精氨酸蛋白酶功能。在本研究中，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)并純化了該目的蛋白。并利用明膠酶譜試驗(yàn)確立了Abp

3、b蛋白酶功能，和pNA偶聯(lián)的合成肽實(shí)驗(yàn)確立了Abpb能高效分解精氨酸肽底物特性。另外重組表達(dá)的Abpb蛋白，能夠體外促進(jìn)RAW264.7分泌高水平炎性因子。對(duì)于Abpb蛋白的免疫原性驗(yàn)證和研究，我們利用小鼠模型，腹腔免疫小鼠，ELISA檢測(cè)血清特異性抗體效價(jià)結(jié)果顯示Abpb能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度特異性抗體，在被動(dòng)攻毒實(shí)驗(yàn)中Abpb能給予小鼠很好的的免疫保護(hù)效果。對(duì)于Abpb基因表達(dá)定位，本研究通過了系列Western blot和流式實(shí)驗(yàn)確

4、認(rèn)了Abpb表達(dá)于豬鏈球菌細(xì)胞壁上以及少量分泌形式的表達(dá)。為了探討Abpb在豬鏈球菌2型感染中所起的作用，我們利用大腸桿菌和豬鏈球菌溫敏型穿梭載體pSET4s在SC19親本株下構(gòu)建了Abpb失活突變株△Abpb。在Balb/C小鼠腹腔感染模型上，突變株△Abpb相比較于野生菌株表現(xiàn)出明顯的毒力下降。由于豬鏈球菌早期的成功粘附和侵入表皮細(xì)胞和隨后的有效逃避和抵抗免疫細(xì)胞清除是豬鏈球菌成功感染的關(guān)鍵步驟，鑒于△Abpb下降的毒力，于是我們比

5、較△Abpb突變株和野生菌株在粘附人喉表皮細(xì)胞Hep-2細(xì)胞能力的差異，結(jié)果顯示Abpb基因突變后，豬鏈球菌對(duì)Hep-2粘附能力下降明顯。與此同時(shí)，本研究分離了小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，在將突變株和野生菌株與其孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞能夠有效的將△Abpb突變株吞噬殺傷，效果為35％左右，然而對(duì)親本株幾乎檢測(cè)不到任何吞噬效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變株△Abpb能夠更易清除，體內(nèi)共感染實(shí)驗(yàn)被采取，在將等劑量的△Abpb突變株和野生菌株SC19混合后感

6、染小鼠，并在不同時(shí)間點(diǎn)分別分離小鼠脾、肝、肺、腦以及血液中△Abpb突變株和親本株SC19含菌量的差異，結(jié)果顯示在感染過程中尤其是早期和晚期中，親本株SC19菌量明顯多于△Abpb突變株，在不同時(shí)間和器官中含量約為△Abpb突變株的2-8倍，這一結(jié)果同樣暗示著Abpb突變后豬鏈球菌削弱的感染能力以及更易清除。
　　通過以上實(shí)驗(yàn)，在此我們鑒定了豬鏈球菌2型細(xì)胞壁精氨酸蛋白酶，并發(fā)現(xiàn)該蛋白酶能夠降解宿主相關(guān)組織和促進(jìn)豬鏈球菌體內(nèi)克隆繁