E血清型沙眼衣原體主要外膜蛋白B細(xì)胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究.pdf

1、目的： 1.預(yù)測(cè)E血清型沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MajorOuterMembraneProtein,MOMP)B細(xì)胞表位，可為其單克隆抗體的制備及表位疫苗設(shè)計(jì)等研究提供理論依據(jù)。 2.構(gòu)建含預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位基因的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/CtMOMPP1P2、pET32a(+)/CtMOMPP5P6和pET32a(+)/CtMOMPP7P8并使之在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并

2、純化，獲得P1P2、P5P6、P7P8表位融合蛋白，以進(jìn)一步鑒定其抗原特性。 3.P1P2、P5P6、P7P8融合蛋白免疫小鼠，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)誘導(dǎo)的鼠血清特異性抗體，及其與Ct全菌體的結(jié)合能力。為Ct相關(guān)疾病的疫苗設(shè)計(jì)及研制相關(guān)診斷試劑奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.以E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株MOMP的完整氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用GOR、Hopp-Woods的親水性方案、Emini表面可及性方案、Jameson-Wolf抗原

3、指數(shù)方案和Janin可及性方案，輔以對(duì)MOMP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域及跨膜區(qū)域的分析，預(yù)測(cè)CtMOMP蛋白的B細(xì)胞表位。 2.選取預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位基因序列，按原核系統(tǒng)偏愛(ài)的氨基酸密碼子優(yōu)化，委托生物技術(shù)公司合成寡核苷酸，退火獲得目的基因，并將目的基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)多克隆位點(diǎn)內(nèi)。將此重組載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)表達(dá)融合蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlot分析鑒定。用Ni-NTA

4、樹(shù)脂親和層析法分別純化表位融合蛋白P1P2、P5P6、P7P8及His蛋白。 3.用純化的蛋白P1P2、P5P6、P7P8作為免疫原，分別于第0w、2w和4w免疫ICR小鼠(9R/組)，并以His蛋白和PBS作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照組。于第0w、1w、3w、5w和17w，每組取小鼠尾靜脈血，制備免疫血清抗體。采用間接ELISA方法檢測(cè)P1P2、P5P6、P7P8蛋白的免疫原性和抗體效價(jià)，及其與Ct全菌體的結(jié)合情況。 結(jié)果：

5、 1.CtMOMP二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)均表明，最有可能的B細(xì)胞表位位于MOMP蛋白N端第73～81區(qū)段、第161～175區(qū)段、第217～225、第261～270區(qū)段和第377～386區(qū)段內(nèi)或它們的附近。 2.酶切鑒定和核苷酸測(cè)序表明，成功構(gòu)建了3個(gè)編碼B細(xì)胞表位的原核表達(dá)質(zhì)粒。SDS-PAGE分析表明，在37℃1.0mMIPTG作用下誘導(dǎo)6h均能很好地表達(dá)目的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為21～22kDa，與預(yù)期Mr大小吻合；

6、蛋白表達(dá)量均約占細(xì)菌總蛋白量的40％。WesternBlot結(jié)果顯示單一明顯條帶，與SDS-PACE中位置吻合。用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析法分別純化得到表位融合蛋白，純度均達(dá)95％以上。 3.3種表位融合蛋白免疫ICR小鼠均可獲得高效價(jià)的免疫血清。經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)：表位融合蛋白均能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；抗體效價(jià)隨免疫次數(shù)增加而升高；融合蛋白P5P6(CtMOMP377～386)、P7P8(CtMOMP261～270)鼠免疫血

7、清中含有Ct全菌體的特異性抗體，與對(duì)照組有顯著性差異；P1P2(CtMOMP73～81)免疫血清中的抗Ct全菌體特異性抗體與對(duì)照組無(wú)明顯差異。 結(jié)論： 1.預(yù)測(cè)并篩選了5個(gè)可能的CtMOMPB細(xì)胞表位。 2.通過(guò)分子克隆分別成功構(gòu)建了3個(gè)含B細(xì)胞表位的重組質(zhì)粒pET32a(+)/CtMOMPP1P2、pET32a(+)/CtMOMPP5P6和pET32a(+)/CtMOMPP7P8；在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)分別高效表達(dá)了