沙眼衣原體E血清型Ⅲ型分泌系統(tǒng)copN基因重組子建立表達(dá)和蛋白鑒定.pdf

1、目的:運(yùn)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建copN-pTrcHisA重組子，E.coli BL21原核表達(dá)CopN蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western B10tting檢測(cè)CopN蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究CopN蛋白的功能和Ⅲ型分泌系統(tǒng)的作用機(jī)制，闡明衣原體的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 (1)取-20℃保存的含有質(zhì)粒的E.coli DH5 α，解凍后吸取100μl菌液接種到LB瓊脂平板上(并加入相應(yīng)含耐藥基因的抗生素)，37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

2、 (2)挑取單菌落接種到3ml LB液態(tài)培養(yǎng)基中(并加入相應(yīng)含耐藥基因的抗生素)，把培養(yǎng)試管放到水浴振蕩器中，37℃，100轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。 (3)將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用低溫離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，棄上清。 (4)加1 mlSTE，懸浮菌體，4℃以12000g離心30秒，棄上清。 (5)重復(fù)步驟(2)，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。 (6)將細(xì)菌沉淀重懸于100μl

3、用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。 (7)加200μl 新配制的溶液Ⅱ。蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上3分鐘。 (8)加150μ1 用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。蓋緊管口，將管倒置后溫和振蕩10秒鐘使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，將管置于冰上3～5分鐘。 (9)用低溫離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

4、(10)加等體積酚：氯仿(1:1)，振蕩混勻，用低溫離心機(jī)于4℃以12000g離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中。 (11)用2倍體積的乙醇沉淀雙鏈DNA，振蕩混合后于室溫放置2分鐘。 (12)用低溫離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘。棄去上清液。 (13)用1m170％7,醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，棄凈上清，在空氣中使核酸沉淀干燥30分鐘。 (14)加50μl 的用滅菌雙蒸水配置的RNA酶(

5、20μg/ml)，以溶解已干燥的DNA沉淀。 (15)取5μl 質(zhì)粒溶液，用1％瓊脂糖凝膠5v/cm電泳，約40分鐘，在紫外線透射反射分析儀下觀察結(jié)果。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建C.t E血清型的TTSS中CopN基因與pTrcHisA質(zhì)粒的重組體CopN-pTrcHisA。 2.本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建CopN重組子的過(guò)程中摸索出適合本實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)方法，獲得了經(jīng)驗(yàn)。 3.構(gòu)建C.t E血清型CopN基因重