鸚鵡熱嗜衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白篩選及致炎作用的研究.pdf

1、鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）是引起寵物鳥和家禽呼吸系統(tǒng)疾病的一種重要病原體。寵物鳥主人、獸醫(yī)和家禽從業(yè)人員很容易感染來自動物的鸚鵡熱嗜衣原體而患病。由于其癥狀與普通感冒很相似，在臨床上常常不易發(fā)現(xiàn)而被誤診，導(dǎo)致該疾病得不到及時有效的治療，致使鸚鵡熱嗜衣原體在患者體內(nèi)持續(xù)存在并引起更嚴重的并發(fā)癥，如肺炎、肺水腫、心肌炎和心內(nèi)膜炎等。因此，研究鸚鵡熱嗜衣原體致病的分子機制，闡明相關(guān)毒力效應(yīng)蛋白的致病

2、作用，對預(yù)防和控制鸚鵡熱嗜衣原體感染有著極其重要的意義。
　?、笮头置谙到y(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）效應(yīng)蛋白在衣原體致病過程中發(fā)揮了非常重要的作用。例如：包涵體膜蛋白（Inclusion membrane protein，Inc），易位性復(fù)原活動磷酸化蛋白（Translocated actin-recruiting phosphoprotein，Tarp）和Ct694介導(dǎo)沙眼衣原體（Chlam

3、ydia trachomatis，Ct）與宿主細胞相互作用，影響宿主細胞正常代謝與功能。鑒于衣原體各種屬之間的相似性，篩選鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白以及研究其生物學(xué)特性能夠為鸚鵡熱嗜衣原體與宿主細胞相互作用提供重要的實驗依據(jù)。因此，為了研究鸚鵡熱嗜衣原體致病的分子機制和闡明鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的致病作用，我們進行了以下三個部分的研究。
　　第一部分鸚鵡熱嗜衣原體T3SS激活JNK/ERK信號通路誘導(dǎo)宿主細胞炎癥反應(yīng)研

4、究
　　鸚鵡熱嗜衣原體是一種嚴格胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原體，通常是由鳥類傳染給人，導(dǎo)致呼吸道感染等多種疾病。目的：初步探討鸚鵡熱嗜衣原體T3SS調(diào)節(jié)宿主細胞炎癥反應(yīng)的作用及其分子機制。方法：采用體外感染模型，鸚鵡熱嗜衣原體感染不同試劑（包括 T3SS抑制劑INP0007、ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑 SP600125、p38抑制劑SB202190和FeSO4）預(yù)處理的人單核細胞株THP-1細胞，利用 ELISA和Q-P

5、CR方法分別檢測炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）的蛋白和mRNA表達水平，Western blotting檢測ERK、JNK和p38磷酸化水平。結(jié)果：T3SS抑制劑INP0007抑制鸚鵡熱嗜衣原體的生長，降低THP-1細胞 IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β炎癥因子的產(chǎn)生，而外源性鐵可逆轉(zhuǎn)INP0007對鸚鵡熱嗜衣原體生長的抑制作用，但是并不能恢復(fù)INP0007對炎癥因子的抑制作用；ERK和JNK抑制劑能減

6、少鸚鵡熱嗜衣原體誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，但是p38抑制劑不能減少鸚鵡熱嗜衣原體誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。結(jié)論：鸚鵡熱嗜衣原體誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生與T3SS有關(guān)，且鸚鵡熱嗜衣原體T3SS通過激活JNK/ERK信號通路誘導(dǎo)宿主細胞炎癥反應(yīng)。
　　第二部分鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白的篩選與鑒定研究
　　目的：初步篩選和鑒定鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白。方法：利用生物信息學(xué)的方法，并結(jié)合相關(guān)文獻對鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白進行篩選，初

7、步預(yù)測了CPSIT_0018、CPSIT_0531、CPSIT_p7三種鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因；采用 PCR技術(shù)從Cps6BC基因組中擴增CPSIT_0018、CPSIT_0531和CPSIT_p7基因，并構(gòu)建pET30a-CPSIT_0018、pET30a-CPSIT_0531和pET30a-CPSIT_p7原核表達載體，然后分別轉(zhuǎn)化到宿主菌 E.coli BL21中，IPTG分別誘導(dǎo)His-CPSIT_0018、Hi

8、s-CPSIT_0531和His-CPSIT_p7三種融合蛋白的表達，分別免疫BALB/c小鼠制備對應(yīng)的多克隆抗體，ELISA分析三種蛋白的免疫原性，間接免疫熒光法觀察 CPSIT_0018、CPSIT_0531和CPSIT_p7蛋白在HeLa細胞中的分布。結(jié)果：成功構(gòu)建了pET30a-CPSIT_0018、pET30a-CPSIT_0531和pET30a-CPSIT_p7三個原核載體，并表達和純化出較穩(wěn)定的重組蛋白；His-CPSIT

9、_0018、His-CPSIT_0531和His-CPSIT_p7三種蛋白均可刺激小鼠產(chǎn)生特定的免疫反應(yīng)，隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度逐漸升高，其中 CPSIT_p7免疫原性最強，抗體滴度為1:1000000，而CPSIT_0018和CPSIT_0531免疫原性相對較弱，抗體滴度均為1:640000；CPSIT_0018和CPSIT_0531蛋白均定位在鸚鵡熱嗜衣原體的包涵體內(nèi)，與主要外膜蛋白 MOMP的分布模式相似，而與包涵體膜蛋白In

10、cA的分布模式不同，CPSIT_p7蛋白不僅局限于包涵體內(nèi)，在HeLa細胞胞漿中也可以見到其分布，用 T3SS阻斷劑干擾細胞后，CPSIT_p7的分布發(fā)生改變，僅位于包涵體內(nèi)，而 CPSIT_0018和CPSIT_0531的分布沒有明顯的改變。結(jié)論：1）獲得了純化的Cps重組蛋白 His-CPSIT_0018，His-CPSIT_0531和His-CPSIT_p7；2） CPSIT_0018，CPSIT_0531和CPSIT_p7重組蛋