鸚鵡熱嗜衣原體急性感染與持續(xù)性感染差異表達(dá)基因篩選.pdf

1、[目的]基因芯片檢測(cè)鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）急性感染與持續(xù)性感染的差異表達(dá)基因，篩選與Cps6BC持續(xù)性感染有關(guān)的關(guān)鍵基因，探討Cps持續(xù)性感染發(fā)生的可能分子機(jī)制。
　　[方法]1.Cps6BC誘導(dǎo)細(xì)胞的急性感染：用Cps6BC標(biāo)準(zhǔn)株感染HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)2h后從培養(yǎng)箱中取出，吸棄感染液，更換為DMEM+10％FBS，37℃培養(yǎng)。2.Cps6BC誘導(dǎo)細(xì)胞的持續(xù)性感染：用 Cps6BC標(biāo)

2、準(zhǔn)株感染 HeLa細(xì)胞，并在感染液中加入35ng/mL rhIFN-γ，培養(yǎng)2h后從培養(yǎng)箱中取出，吸棄感染液，更換為含35ng/mL rhIFN-γ的衣原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。3.分別收集6、12、24、36、48、60h Cps6BC急性感染與持續(xù)性感染的HeLa細(xì)胞，提取CpsRNA后，采用Agilent8×15KCps全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)、比較分析急性感染與持續(xù)性感染中 Cps的差異表達(dá)基因，然后用Absolute Fold

3、 change≥2為顯著上調(diào)，F(xiàn)old change≤0.5為顯著下調(diào)，同時(shí)Flag標(biāo)記為Detected的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異基因篩選，運(yùn)用GO分類、KEGG代謝通路及DAVID在線軟件對(duì)差異基因進(jìn)行功能聚類及通路分析，并通過(guò)Realtime-PCR確證部分差異基因。
　　[結(jié)果]通過(guò)比較Cps急性感染與持續(xù)性感染，發(fā)現(xiàn)在12~60h共有持續(xù)性感染差異表達(dá)基因287個(gè)，包括74個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，以及213個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，GO分類的BP分析

4、顯示，21個(gè)持續(xù)性感染表達(dá)上調(diào)基因參與1個(gè)與翻譯相關(guān)的BP分類“translation”，EASE score為3.58E-09，58個(gè)持續(xù)性感染表達(dá)下調(diào)基因參與8個(gè)BP分類，其中能量代謝相關(guān)的“oxidation reduction”、參與氨基酸合成及代謝的“tetrapyrrole biosynthetic process”、“tetrapyrrole metabolic process”EASE Score最低，小于0.03。57

5、個(gè)持續(xù)性感染表達(dá)上調(diào)基因參與4個(gè)MF分類,“structural molecule activity”、“structure constituent of ribosome”、“rRNA binding”ESAEScore較低，小于9.6E-6。41個(gè)持續(xù)性感染表達(dá)下調(diào)基因參與8個(gè)MF分類，主要涉及核苷酸及無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)等，其中“nucleotidyltransferase activity”、“sodiumion binding”、“o

6、xidoreductase activity”的EASE Score最低，小于0.03。利用KEGG pathway分析顯示，當(dāng)EASE Score＜0.1時(shí)，有18個(gè)持續(xù)性感染表達(dá)上調(diào)基因參與了1條“KEGG-pathway”；38個(gè)持續(xù)性感染表達(dá)下調(diào)基因參與了5條“KEGG-pathway”。將持續(xù)性感染差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)功能進(jìn)行“Functional Annotation Clustering”分析，結(jié)果顯示持續(xù)性感染表達(dá)上

7、調(diào)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚成4個(gè)集合，其中Enrichment Score最高的功能集合與rRNA的合成相關(guān)。持續(xù)性感染表達(dá)下調(diào)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚成23個(gè)集合，其中Enrichment Score最高的功能集合與某些生物合成及代謝相關(guān)。Real time-PCR檢測(cè)目的基因CPSIT_0739（6h）、CPSIT_0043（12h）、CPSIT_0531（36h）、 CPSIT_0555（48h）的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果均與芯