羊種布魯氏菌持續(xù)性感染巨噬細(xì)胞機(jī)制研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一類動(dòng)物源性人獸共患病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其是發(fā)展中國(guó)家。近幾年回升勢(shì)頭迅猛。布魯氏菌主要毒力表現(xiàn)在能侵入宿主細(xì)胞并在其中生存增殖形成持續(xù)性感染的能力。布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞后逃避與溶酶體融合以及抑制宿主細(xì)胞凋亡是其在胞內(nèi)形成持續(xù)性感染的重要原因，目前大量的研究表明自噬與凋亡及溶酶體融合降解途徑密切相關(guān)，布魯氏菌激活自噬途徑及其相關(guān)機(jī)制的研究尚不多見(jiàn)。
　　目的：本文以羊種布魯氏菌參考株16M（以下

2、簡(jiǎn)稱16M）感染巨噬細(xì)胞為模型，研究布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞后：（1）是否激活巨噬細(xì)胞自噬途徑。（2）自噬途徑的激活對(duì)羊種布魯氏菌胞內(nèi)生存繁殖的影響。（3）羊種布魯氏菌激活巨噬細(xì)胞的自噬對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。（4）羊種布魯氏菌激活巨噬細(xì)胞自噬對(duì)溶酶體與布魯氏菌融合率的影響.探討布魯氏菌感染后激活自噬途徑與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系以及對(duì)溶酶體途徑的影響，揭示布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機(jī)制，為布魯氏菌病新藥物研發(fā)、防治及家畜抗病育種工作奠定基礎(chǔ)

3、。
　　方法：（1）通過(guò)對(duì)自噬泡特異性標(biāo)記物GFP-LC3陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)的統(tǒng)計(jì)以及研究自噬最經(jīng)典的方法電鏡技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)羊種布魯氏菌16M（16M）侵染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞自噬活性的變化。(2）16M侵染巨噬細(xì)胞后，利用自噬的抑制劑3-MA抑制細(xì)胞自噬或利用RNA干擾技術(shù)沉默自噬泡形成過(guò)程中的必需基因Beclin-l，檢測(cè)16M胞內(nèi)CFU；同時(shí)用MTT法檢測(cè)自噬抑制劑3-MA和Beclin-l干擾載體對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響.（3）用16M侵染小鼠巨

4、噬細(xì)胞RAW264.7后，利用自噬抑制劑3-MA干預(yù)巨噬細(xì)或用RNA干擾技術(shù)沉默自噬起始基因Belclin-1后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞的凋亡率，用western-blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬被16M激活和被Beclin-1干擾質(zhì)粒抑制后Caspase-8,9激酶的活性變化以及細(xì)胞色素C的水平。（4）用可表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pWal-GFP電轉(zhuǎn)化布魯氏菌,將電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pWal-GFP的布魯氏菌侵染溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracke

5、rRed標(biāo)記的巨噬細(xì)胞,用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)布魯氏菌和溶酶體的共定位區(qū)域。
　　結(jié)果：（1）與未侵染16M的對(duì)照組相比，在16M侵染組中：激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到GFP-LC3陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)顯著增多（p<0.05）；電鏡檢測(cè)到典型的雙/多層膜自噬小體結(jié)構(gòu)；western-blot檢測(cè)顯示自噬小體表面微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(LC3-II)的表達(dá)量顯著提高，LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化率在侵染12小時(shí)后達(dá)到最高水平。（2）在感染16M24

6、h，48h時(shí)，自噬抑制劑3-MA抑制細(xì)胞自噬后與對(duì)照組相比侵染組胞內(nèi)布魯氏菌數(shù)顯著降低（P<0.05）；RNA干擾技術(shù)沉默自噬泡形成過(guò)程中的必需基因Beclin-l后胞內(nèi)布魯氏菌數(shù)也顯著下（p<0.05）。MTT法檢測(cè)3-MA和RNA干擾質(zhì)粒均不影響細(xì)胞活性。（3）3-MA處理組巨噬細(xì)胞的凋亡率和Belclin-1干擾組的凋亡率均高于16M侵染組，并且差異性顯著（P<0.05）。自噬抑制劑的應(yīng)用和自噬起始基因的沉默在降低細(xì)胞自噬的同時(shí)，

7、增強(qiáng)了細(xì)胞的凋亡比例；與16M侵染組相比Beclin-1干擾組細(xì)胞的Caspase-9的活性明顯上調(diào)，而Caspase-8的活性則沒(méi)有明顯改變；3-MA組和Beclin-1干擾組中，細(xì)胞色素C明顯高于16M侵染組。（4）胞漿中的紅色顆粒狀熒光即為溶酶體，綠色顆粒是布魯氏菌,二者存在共定位區(qū)域（黃色）.隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞(視野)統(tǒng)計(jì)胞內(nèi)黃色斑點(diǎn)數(shù),添加3-MA自噬抑制劑后胞內(nèi)黃色斑點(diǎn)數(shù)明顯增多（p<0.05）。.
　　結(jié)論：16M