AAV介導(dǎo)的HBV持續(xù)性感染和纖維化小鼠模型的建立及抗病毒藥物評(píng)估.pdf

1、背景:
　　乙型肝炎病毒引起的慢性乙型肝炎是一種重大的傳染性疾病。乙型肝炎主要流行于中國(guó)及其它一些亞洲國(guó)家，目前約有十分之一的中國(guó)人口是乙型肝炎病毒攜帶者。慢性乙型肝炎可以導(dǎo)致肝硬化及肝癌的發(fā)生，并且目前沒(méi)有藥物可以完全根治，治療種類少且療效有限。因此，尋找一種有效的治療乙型肝炎的方法迫在眉睫。
　　RNA干擾(RNA interfering)是指一些小的雙鏈RNA(dsRNA)可高效、特異的促使mRNA降解，阻斷相應(yīng)基因表

2、達(dá)。應(yīng)用RNAi治療乙型肝炎是一種有效的治療策略，能夠突破普通藥物治療療效的局限性，克服易產(chǎn)生逃逸突變株使病情更加惡化等缺點(diǎn)。但化學(xué)合成的siRNA成本高、不穩(wěn)定、體內(nèi)傳輸困難，進(jìn)入細(xì)胞后易被降解，因此，需要研發(fā)一種新的傳輸方式，病毒載體為我們提供了一個(gè)契機(jī)。
　　腺相關(guān)病毒AAV(Adeno associated virus)屬于人類細(xì)小病毒科(parvoviridae)。自建立第一個(gè)AAV的感染性克隆以來(lái)，重組AAV載體被廣泛

3、應(yīng)用到基因治療研究及臨床前/臨床實(shí)驗(yàn)中，嘗試治療多種疾病。AAV具有無(wú)致病性、低免疫原性、能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂的細(xì)胞、可介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本課題選擇腺相關(guān)病毒作為短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)傳遞的載體，進(jìn)行抗乙型肝炎病毒的研究。
　　乙型肝炎病毒宿主范圍窄，且沒(méi)有適合的動(dòng)物模型進(jìn)行抗病毒藥物的評(píng)估，嚴(yán)重制約了抗乙型肝炎病毒藥物的研發(fā)。因此研發(fā)一種新型的乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型對(duì)研究慢性乙型肝炎的致病機(jī)制及新型

4、抗病毒藥物的篩查和評(píng)估具有重要意義。
　　目的:
　　1、構(gòu)建乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型。
　　2、構(gòu)建一系列AAV2-shRNA表達(dá)載體，體外驗(yàn)證各AAV2-shRNA的抗病毒效果。
　　3、在乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型上評(píng)估AAV2-shRNA的抗病毒效果。
　　方法:
　　1、將可復(fù)制性的1.2拷貝的HBV克隆到去除rep和cap基因的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒表達(dá)載體pSSV9（rep-/cap-

5、）中，構(gòu)建出質(zhì)粒表達(dá)載體pSSV9-1.2HBV，并利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)制備成重組病毒(AAV8-1.2HBV)。將AAV8-1.2HBV尾靜脈注射C57BL/6小鼠，定期采血、取組織樣本通過(guò)qPCR、RT-qPCR、ELISA、免疫組織化學(xué)染色、Masson染色等方法檢測(cè)血清中HBV DNA變化、肝組織中HBV cDNA變化、血清中抗原分泌情況、肝細(xì)胞內(nèi)抗原表達(dá)情況、病理變化及模型小鼠肝組織纖維化指標(biāo)的變化等。
　　2、制備一系

6、列shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSC-H1-shRNA和串聯(lián)形式的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSC-H1-shRNAmultiple，利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)包裝成AAV2-shRNA重組病毒。用AAV2-shRNA重組病毒感染HepG2.2.15細(xì)胞系，定期收獲培養(yǎng)上清液和培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)qPCR、RT-qPCR和ELISA等方法從DNA水平，RNA水平和蛋白水平評(píng)估各AAV2-shRNA抗病毒效果。
　　3、將體外篩選出的抗病毒效果顯著的AA

7、V2-shRNA病毒尾靜脈注射乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型，定期采血、取組織樣本通過(guò)測(cè)量與方法1中相同的各項(xiàng)指標(biāo)，評(píng)估AAV2-shRNA體內(nèi)抗HBV的效果。
　　結(jié)果:
　　1、模型小鼠血清中可持續(xù)檢測(cè)到高滴度的HBV DNA(107 copy/mL)超過(guò)6個(gè)月;模型小鼠血清和肝細(xì)胞中分別可檢測(cè)到HBsAg、 HBeAg的分泌與HBsAg、HBcAg的表達(dá)。病理切片及纖維化指標(biāo)定量檢測(cè)顯示，小鼠肝組織沒(méi)有明顯的急性炎癥反

8、應(yīng)，但是能誘導(dǎo)肝組織脂肪變性和纖維化。
　　2、所有的AAV2-shRNA體外均有抑制HBV的能力，抗病毒效果呈劑量依賴關(guān)系，但是感染劑量超過(guò)MOI=104時(shí)，抗HBV效果未有顯著增加。相同感染劑量下，AAV2-shRNA1+3對(duì)HBV的抑制率要顯著大于AAV2-shRNA1和AAV2-shRNA1+3+4。
　　3、體內(nèi)驗(yàn)證AAV2-shRNA1，AAV2-shRNA1+3抗HBV效果，各項(xiàng)結(jié)果顯示AAV2-shRNA1+

9、3具有更強(qiáng)的抗病毒能力，與體外結(jié)果相符。檢測(cè)纖維化相關(guān)指標(biāo)顯示，AAV2-shRNA1+3進(jìn)行抗HBV治療可以改善肝組織脂肪變性和肝組織纖維化的程度。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了乙型肝炎病毒持續(xù)性感染小鼠模型，此模型不產(chǎn)生明顯的急性炎癥反應(yīng)，但是能誘導(dǎo)小鼠肝組織纖維化，為慢性乙型肝炎和肝硬化治療藥物的篩選和評(píng)估提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。
　　2、體外篩選出的AAV2-shRNA1+3，具有顯著的抗HBV復(fù)制的作用。