早期應(yīng)用抗病毒藥物聯(lián)合DNA疫苗對(duì)旱獺WHV感染過程的影響.pdf

1、目的：
　　1.研究不同地區(qū)旱獺對(duì) WHV的易感性,了解不同毒株、不同劑量的WHV接種旱獺后的自然經(jīng)過,完善 WHV感染的旱獺模型,。
　　2.建立旱獺 T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)方法。
　　3.研究恩替卡韋聯(lián)合 DNA疫苗 pWHcIm對(duì) WHV感染的早期干預(yù)作用。
　　方法：
　　1.捕獲來自不同地區(qū)的旱獺,靜脈接種含有 WHV病毒的血清,觀察其對(duì) WHV的易感性;用不同的WHV毒株接種易感地區(qū)的旱獺,觀

2、察不同毒株的影響;分別用高,中,低劑量的WHV59毒株接種易感地區(qū)的旱獺,觀察不同劑量的WHV接種后的自然經(jīng)過。
　　2.分離旱獺PBMC,建立旱獺T細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)方法,包括CFSE染色檢測(cè)旱獺 PBMC增殖,CD107a檢測(cè)旱獺特異性 CTL應(yīng)答,PD1,PDL1,FOXP3染色及其免疫應(yīng)答相關(guān)分子 mRNA表達(dá)的real-time RT-PCR的方法。
　　3.野外捕獲的成年旱獺24只,體重在2-3kg。經(jīng)足背靜脈接種含

3、有 WHV59病毒的血清,病毒接種后24小時(shí),18只旱獺分別經(jīng)過如下三種處理:口服抗病毒藥物恩替卡韋,0.5mg/kg/day,持續(xù)服用8周;在接種病毒后的第1,4,7周用表達(dá) WHV核心抗原的質(zhì)粒免疫;口服恩替卡韋聯(lián)合質(zhì)粒免疫。余下6只旱獺作為空白對(duì)照。20周后,旱獺接種 WHV0908毒株。選擇2只健康旱獺作為此次病毒接種的對(duì)照。應(yīng)用ELISA、real-time-PCR檢測(cè)旱獺血清 WHV感染標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化:WHsAg、WHsA

4、b、WHcAb和WHV DNA。real-time-RT-PCR檢測(cè)旱獺 PBMC中免疫應(yīng)答相關(guān)分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.來自1,3地區(qū)的喜馬拉雅旱獺對(duì) WHV易感,病毒呈現(xiàn)高復(fù)制;WHV59毒株使喜馬拉雅旱獺出現(xiàn)急性感染,而WHV59的傳代毒株(stock0908和stock0925)使旱獺同樣出現(xiàn)急性感染;中劑量 WHV59接種后旱獺出現(xiàn)病毒血癥的時(shí)間延遲,而低劑量 WHV接種旱獺后不能出現(xiàn)病毒血癥。
　　

5、2.新鮮分離的旱獺 PBMC進(jìn)行 CFSE染色,5μg/ml的ConA刺激旱獺淋巴細(xì)胞5天, CFSEdim CD4+細(xì)胞百分比高達(dá)92.15％。新鮮分離急性 WHV感染旱獺的PBMC,2μg/ml WHc96-110的肽段特異性刺激3天后,CD3+CD4-CD107a的表達(dá)為3.98％,相比2μg/ml CMV無關(guān)多肽刺激(0.85％)和空白對(duì)照(0.67％)有明顯的增高。在病毒血癥高峰期,CD4-細(xì)胞的PD-1表達(dá)達(dá)到高峰,陽性細(xì)胞

6、百分比達(dá)到13.77％, CD4+細(xì)胞的FOXP3的表達(dá)為4.44％,PD-L1在病毒血癥晚期 CD4+和CD4-T細(xì)胞均有短暫上調(diào),其百分比分別為2.17％和6.05％,病毒清除后降至正常水平。
　　3.24只成年旱獺初次 WHV感染后,所有僅用DNA疫苗免疫的旱獺均出現(xiàn)病毒血癥和核心抗體,與未處理的對(duì)照旱獺相似。除僅用恩替卡韋處理的2只旱獺未出現(xiàn)WHcAb外,恩替卡韋聯(lián)合質(zhì)粒免疫及僅用恩替卡韋處理的所有旱獺均出現(xiàn)WHcAb而未

7、出現(xiàn)病毒血癥。再次病毒接種后,所有的質(zhì)粒免疫旱獺,恩替卡韋聯(lián)合質(zhì)粒免疫的旱獺以及未處理的對(duì)照動(dòng)物及其部分僅用恩替卡韋處理的旱獺(4/6)均不出現(xiàn)病毒血癥。
　　結(jié)論：
　　1.旱獺的遺傳背景及病毒的接種劑量影響 WHV感染的結(jié)局,傳代病毒接種產(chǎn)生與原代病毒感染類此的感染結(jié)局。
　　2.建立了旱獺 T細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)方法,為旱獺 WHV感染模型應(yīng)用于 HBV感染的免疫發(fā)病機(jī)制研究及評(píng)估免疫治療策略提供研究手段。
　　

8、3.早期應(yīng)用抗病毒藥物和/或抗病毒藥物聯(lián)合 DNA疫苗,可以抵御 WHV的初次感染,且部分或全部旱獺產(chǎn)生了有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答,可以抵御 WHV的再次感染。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義：
　　1.旱獺廣泛分布在我國(guó)西北特別是青藏高原,與土撥鼠種系(線粒體 DNA序列分析)發(fā)生十分接近,近年已經(jīng)報(bào)道中國(guó)旱獺對(duì) WHV有易感性,因此 WHV感染旱獺模型非常適合于研究嗜肝病毒的急慢性感染。
　　2.首次在旱獺 WHV感染模型體

9、內(nèi)建立 T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)方法,包括 CFSE染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖,CD107a及流式細(xì)胞術(shù)分析特異性 CTL應(yīng)答,real-time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá),為旱獺模型的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供研究手段。
　　3.首次利用WHV感染旱獺模型研究早期應(yīng)用抗病毒藥物和/或抗病毒藥物聯(lián)合DNA疫苗對(duì) WHV感染過程的影響,為探討 HBV感染后的早期免疫應(yīng)答及保護(hù)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為 HBV意外或針刺暴露者提供新的