羊種布魯氏菌hfq突變株毒力及其免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、布魯氏菌?。˙rucellosis，簡(jiǎn)稱布?。┦且环N可累及全身多個(gè)器官與系統(tǒng)，有潛在致命危險(xiǎn)的動(dòng)物源性傳染病，給全球經(jīng)濟(jì)與人類健康帶來了巨大威脅。布魯氏菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，無質(zhì)粒與外毒素，在宿主細(xì)胞內(nèi)有頑強(qiáng)的生存與繁殖能力。人與動(dòng)物感染后主要呈現(xiàn)流產(chǎn)、不孕、空懷、睪丸炎、關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎等臨床癥狀。細(xì)菌RNA分子伴侶蛋白Hfq(host factor for RNA phage Qβ replicase)是細(xì)菌重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。研究

2、發(fā)現(xiàn)Hfq不僅影響病原體在各種壓力條件下的生存與繁殖能力，還調(diào)控大量與毒力相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步明確Hfq與布魯氏菌的胞內(nèi)生存能力、毒力之間的關(guān)系和缺失hfq后對(duì)布魯氏菌免疫保護(hù)作用的影響，進(jìn)行了以下研究:
　　羊種布魯氏菌缺失hfq后對(duì)其毒力影響的研究，主要包含羊種布魯氏菌野生株(16M)、羊種布魯氏菌hfq突變株(16M△hfq)及羊種布魯氏菌hfq互補(bǔ)株(16M△hfq-C)RAW264.7細(xì)胞侵染試驗(yàn)、BALB/c小鼠

3、毒力試驗(yàn)與小鼠感染過程中布魯氏菌毒力相關(guān)基因omp25，omp31，vjbR，htrA，gntR，dnaK轉(zhuǎn)錄情況分析試驗(yàn)。結(jié)果顯示:與16M相比，16M△hfq胞內(nèi)生存能力與毒力都顯著減弱，hfq在感染RAW264.7細(xì)胞中，早期轉(zhuǎn)錄水平高，而在感染小鼠體內(nèi)，中后期轉(zhuǎn)錄水平高。在小鼠感染過程中，毒力相關(guān)基因omp25，omp31，vjbR，htrA，gntR，dnaK在16M△hfq中大部分時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄下調(diào)，在16M△hfq-C中，轉(zhuǎn)錄

4、得到恢復(fù)，提示在感染過程中Hfq對(duì)這些毒力相關(guān)基因主要起正向調(diào)控作用。
　　為研究Hfq對(duì)布魯氏菌免疫保護(hù)作用的影響，進(jìn)行了16M△hfq免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)試驗(yàn)。用16M△hfq感染BALB/c小鼠，PBS做對(duì)照，第45d對(duì)兩組小鼠進(jìn)行16M攻毒試驗(yàn)，攻毒后第14d與第28d脫頸處死小鼠，無菌取脾后對(duì)脾臟內(nèi)CFU計(jì)數(shù)，初步評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)作用。此外，通過BALB/c小鼠毒力試驗(yàn)與攻毒試驗(yàn)，獲得小鼠脾臟cDNA樣本和小鼠血清樣本，采用q

5、PCR法與ELISA法監(jiān)測(cè)感染小鼠不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子的變化。同時(shí)，采用ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清IgG水平。結(jié)果顯示:從攻毒后脾臟CFU計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS組相比，16M△hfq在第14d提供了顯著的免疫保護(hù)作用，差異顯著，在第28d，16M△hfq組小鼠脾臟內(nèi)布魯氏菌已完全被清除。從小鼠細(xì)胞因子與IgG水平監(jiān)測(cè)結(jié)果可知，qPCR法與ELISA法監(jiān)測(cè)到小鼠血清中細(xì)胞因子水平結(jié)果趨勢(shì)匹配。小鼠感染過程中IL-2、IFN-γ、 IL-10、

6、IL-4，與16M組相比大部分時(shí)間點(diǎn)均顯著下降，攻毒后4個(gè)細(xì)胞因子水平不同程度增高或降低，差異顯著(P＜0.05)。第7d，16M△hfq組血清就能檢測(cè)出抗體，然后持續(xù)上升，第45d達(dá)到最高OD450nm=0.57，攻毒后小鼠血清中抗體再次升高，攻毒后第28d，抗體水平達(dá)到OD450nm=0.79，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與PBS組相比，差異顯著(P＜0.05)。保護(hù)性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果說明16M△hfq使宿主產(chǎn)生了特異性免疫反應(yīng)，具有良好的免疫保護(hù)作用。