布魯氏菌部分體內(nèi)感染因子免疫保護的研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的慢性傳染病,是目前世界上流行最廣、危害最大的人畜共患病之一,在我國被列為法定二類傳染病。布魯氏菌病嚴重威脅著人、畜健康。減毒活疫苗是當前應用最廣泛的布魯氏菌疫苗,有較好的免疫保護力,但存在諸如毒力易返強等安全問題。滅活疫苗只能提供短暫的保護力。相比之下,亞單位疫苗組分明確,有疫苗的生產(chǎn)容易控制,且副作用小的優(yōu)點,故具有廣闊的前景。
　　布魯氏菌毒力因子和胞內(nèi)

2、寄生機制的研究已成為國內(nèi)外學者研究的重點。研究表明,布魯氏菌基因組中許多基因與布魯氏菌生長、侵襲、寄生和免疫等功能密切相關,但仍有約22％的編碼基因功能不明。實驗室的前期研究中,使用體內(nèi)誘生抗原技術(in vivo-induced antigen technology,IVIAT)篩選到33個體內(nèi)感染因子,對其中部分體內(nèi)感染因子進行免疫保護的研究,旨在為防控布魯氏菌病篩選到更多的保護性抗原。
　　首先,選取IVIAT篩選到的體內(nèi)感

3、染基因YaeC、Asly、EcoA、MDH、SDR、Fumhy、nitrite、EnvZ、GntR、Arg和Sugar11個,在大腸桿菌中表達、純化。分別擴增11個編碼布魯氏菌體內(nèi)感染基因片段,克隆至原核表達載體pET28a(+),構建重組表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG誘導表達的各重組蛋白,經(jīng)親和層析法進行純化。
　　以MDH蛋白作為陽性對照,對其余10種重組蛋白與纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原的結合活

4、性進行檢測,同時使用已知的沒有結合活性的BSA作為陰性對照。結果表明,在11個重組蛋白與纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原的結合活性檢測,篩選到的Asly、EcoA、MDH、SDR、Fumhy、nitrite、EnvZ、Arg、Sugar9個蛋白都能與纖連蛋白及纖連蛋白溶酶原結合,推測這些蛋白可能在布魯氏菌黏附和侵入宿主細胞的過程中發(fā)揮一定的作用,可能參與布魯氏菌的致病性及其在宿主細胞內(nèi)的存活與增殖。
　　其次,利用獲得的重組蛋白免疫小鼠,

5、對免疫小鼠的體液免疫指標和細胞免疫指標分別進行檢測,以便對重組蛋白的免疫保護性進行分析。具體是將蛋白以佐劑乳化后免疫小鼠,在免疫后不同時間分別開展對小鼠的抗體效價的測定、外周血淋巴細胞亞型的鑒定,外周血中細胞因子含量的測定。結果,抗體檢測在二次免疫后各免疫組均能產(chǎn)生較高水平的特異性抗體。
　　對攻毒后的免疫小鼠血清中細胞因子檢測結果表明,攻毒后Asly、nitrite和sugar蛋白免疫組血清中IFN-γ的含量極顯著的高于對照組(

6、p<0.01),而IFN-γ主要是由免疫系統(tǒng)中的T細胞和NK細胞產(chǎn)生以清除宿主細胞內(nèi)的病原,從而保護宿主免受布魯氏菌的感染。IL17A含量也有顯著高于對照組(p<0.05),IL17A含量的上升顯示出Th17細胞的活化,而Th17細胞的活化能有效的介導組織的炎癥反應,從而加速機體對布魯氏菌的清除與殺滅,保護機體免受感染。
　　最后,對免疫后的小鼠,用感染B.abortus2308攻毒后10天,進行小鼠脾臟內(nèi)細菌數(shù)計數(shù),評價各重組蛋

7、白對免疫小鼠脾臟載菌量的影響。結果表明,Asly、nitrite和sugar可以保護小鼠抵抗布魯氏菌的感染,具有較好的免疫保護效果,免疫組小鼠脾臟載菌量和對照組小鼠有顯著的差別,Asly免疫組小鼠脾臟的載菌量比對照組減少2倍多,nitrite免疫組減少7倍,而sugar免疫組更是減少了14倍;流式細胞術檢測結果表明,Asly和sugar免疫組的CD4+/CD8+比值要顯著低于對照組,而nitrite免疫組的CD4+/CD8+比值要顯著高