中華絨螯蟹對細菌的清除作用及部分免疫因子的初步研究.pdf

1、隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，病害同益嚴重并造成巨大的經(jīng)濟損失，成為生產(chǎn)發(fā)展的主要制約因素，及時有效地防治疾病危害已成為滿足中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的迫切要求。研究中華絨螯蟹的免疫功能，提高其自身免疫力，是解決其病害防治問題的重要途徑之一。本論文對中華絨螫蟹血淋巴的抗菌活性，血淋巴酚氧化酶的部分生化特性，血清的凝集活性，血細胞的體外吞噬能力以及對細菌的清除作用等基礎(chǔ)免疫功能進行了初步研究，探討了中華絨螫蟹對細菌的清除作用，部分免疫因

2、子的性質(zhì)及其在細菌清除中的作用，以期能夠為中華絨螯蟹細菌性疾病免疫防治工作的開展提供理論參考。 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)對于甲殼動物清除侵入體內(nèi)細菌，維持機體健康具有重要作用，因此探討了中華絨螯蟹血清和血細胞溶解上清液(HLS)對大腸桿菌Escherichiacoli、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus4種細菌的抗菌活性、

3、不同濃度血細胞溶解上清液(Hemocyte Lysate Supernatant，HLS)對抗菌活性的影響以及血清中抗菌活性的誘導。結(jié)果顯示，只有HLS對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，而血清對4種菌和HLS對蠟狀芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌均未表現(xiàn)出抗菌活性；隨著HLS濃度的降低，大腸桿菌的細菌存活指數(shù)(SI)迅速上升，抗菌活性迅速下降，HLS濃度高低直接影響抗菌活性的強弱；通過注射滅活大腸桿菌，血清在1h-24h內(nèi)表現(xiàn)出抗菌

4、活性的誘導作用，6h時抗菌活性最強。 酚氧化酶原系統(tǒng)對甲殼動物的免疫識別及免疫調(diào)理功能具有重要作用，故對中華絨螯蟹血淋巴的血清、血漿和血細胞溶解上清液(HLS)中酚氧化酶(PO)的活力以及該酶最適pH和溫度進行了初步研究，結(jié)果表明在血清和HLS中都有PO活力，而血漿中無PO的存在，血清中的PO來自于血細胞；以L-Dopa為底物，中華絨螫蟹.PO活力的最適pH值為6.5，最適溫度為40℃。采用SDS、Ca<'2+>、Mg<'2+>

5、以及SDS與Ca<'2+>聯(lián)合和SDS與Mg<'2+>聯(lián)合分別對酚氧化酶原(proPO)進行激活實驗，血清和HLS中的PO活力都有顯著的增加，其中SDS的激活作用最強，Ca<'2+>、Mg<'2+>的激活作用最弱，SDS與Ca<'2+>聯(lián)合和SDS與.Mg<'2+>聯(lián)合的混合激活作用介于SDS和Ca<'2+>、Mg<'2+>之間，激活實驗表明中華絨螫蟹的PO主要以酚氧化酶原(proPO)形式存在于血細胞中。 甲殼動物凝集素具有多

6、種生理生化功能，如能夠凝集細菌、細胞；增強細胞吞噬活性等。以醛化紅細胞為實驗材料，確定了中華絨螯蟹血清中含有能夠凝集醛化雞紅細胞和醛化鼠紅細胞的凝集素，其凝集效價分別為2<'4>和2<'7>，但中華絨螫蟹血清對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、蠟狀芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌無凝集活性。利用血清能夠凝集醛化雞紅細胞的特點，對凝集素進行了初步分離，經(jīng)SDS-PAGE電泳測得其分子量為77kDa。 吞噬作用是甲殼動物保護自身免受微生物侵害的重要免

7、疫功能，測定其體外吞噬能力對于評價免疫系統(tǒng)的狀態(tài)具有重要意義。采用體外血細胞培養(yǎng)的方法，研究了中華絨螯蟹血細胞對蠟狀芽孢桿菌和醛化鼠紅細胞的吞噬能力。結(jié)果表明：在體外，貼壁培養(yǎng)的中華絨螯蟹血細胞1hr的存活率可達92.5±0.9％。少量的細胞呈圓形或橢圓形，細胞內(nèi)含有大量具有明顯的折光性的顆粒，細胞貼壁性能差；絕大部分貼壁的細胞，呈扁平狀，其胞質(zhì)內(nèi)含有一個明顯的細胞核和一些小的顆粒，緊密地貼附于玻片上并伸出類似于偽足的原生質(zhì)突起，伸展后

8、血細胞的長度可達數(shù)十微米，具有吞噬功能，其對蠟狀芽胞桿菌吞噬率為5.1±1.4％，不能吞噬小鼠紅細胞，血清孵育不能增強中華絨鰲蟹血細胞體外吞噬能力。 在對中華絨螯蟹幾種免疫因子體外研究的基礎(chǔ)上，探討了中華絨螯蟹對侵入體內(nèi)細菌的清除作用。首先采用顏料法確定了中華絨螯蟹循環(huán)血體積(V)與體重(T)問的回歸曲線方程V=0.1576T-0.898(Rs=0.83，P<0.01)，循環(huán)血體積與體重的百分比(V/T)為14.86±2.95％

9、。在確定中華絨螯蟹循環(huán)血體積的基礎(chǔ)上，通過注射革蘭氏陽性蠟狀芽孢桿菌和革蘭氏陰性大腸桿菌，探討進入中華絨螯蟹體內(nèi)細菌隨時間變化的清除規(guī)律以及通過組織學觀察探討細菌的清除方式。結(jié)果表明：中華絨螯蟹對兩種細菌的清除作用相似，在注射菌后60min時對蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌的細菌清除率都達到最高，分別為88.57±4.84％和90.15±3.88％，120min時對兩種細菌清除率與60min時相比無顯著性差異(P>0.05)；中華絨螯蟹的鰓和心