布魯氏菌減毒活疫苗株adh缺失標(biāo)記及其鑒別診斷研究.pdf

1、布魯氏病是布魯氏桿菌引起的一種在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播的人畜共患病，嚴(yán)重制約著畜牧業(yè)的發(fā)展。在我國把其定為乙類傳染病。根據(jù)對宿主的偏好，布魯氏菌分為六個(gè)種，分別為馬耳他布魯氏桿菌Br.melitensis、流產(chǎn)布魯氏桿菌Br.abortus、豬布魯氏桿菌Br.suis、綿羊布魯氏桿菌Br.ovis、沙林鼠布魯氏桿菌Br.neotomae和犬布魯氏桿菌Br.canis。目前預(yù)防布病最有效的辦法就是接種疫苗，現(xiàn)用的疫苗主要包括減毒活疫苗，滅活

2、疫苗和亞單位疫苗等。由于滅活疫苗接種后不能在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)復(fù)制，使用接種量比較大，免疫期較短還要加入適當(dāng)?shù)淖魟┖蛠唵挝灰呙缟a(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)，目前預(yù)防布病使用最廣泛的還是減活疫苗。市場上用的減毒活疫苗主要包括A19,S2,M5,104M,Rev.1,RB51等。
　　 雖然減活疫苗對布病的預(yù)防控制取得了很好的效果，但同樣存在一些問題，如減活疫苗毒性較強(qiáng)，接種疫苗后的動(dòng)物患上布病，無法區(qū)別是疫苗感染還是野生株感染。針對上述缺點(diǎn)，本論文

3、將減毒活疫苗的adh基因缺失，使其毒力下降，原核表達(dá)adh基因成蛋白，用免疫血清學(xué)方法鑒別診斷免疫感染和自然感染，具體試驗(yàn)如下:
　　 試驗(yàn)1布魯氏菌減毒活疫苗株adh基因缺失標(biāo)記
　　 本部分試驗(yàn)通過基因芯片和蛋白芯片挑選出毒力相關(guān)基因adh，adh是表面抗原基因，從我們實(shí)驗(yàn)室中做的蛋白芯片結(jié)果來分析，adh蛋白具有診斷抗原性。基于adh基因的這個(gè)特性，選擇布魯氏菌常用的減毒活疫苗株S2，M5，A19以adh基因?yàn)榘袠?biāo)

4、基因，運(yùn)用同源重組的原理，用抗性替代的方法成功構(gòu)建了缺失adh基因的標(biāo)記疫苗株。在試驗(yàn)中，采取了PCR融合的方法，首先擴(kuò)增adh基因的N，C端同源臂和卡那基因，并將融合在一起構(gòu)建成突變盒，其中卡那基因在adh基因N，C端同源臂之間;其次將突變盒連接到pMD19-TVector（以下簡稱T載體）構(gòu)建成突變載體;最后將突變載體電轉(zhuǎn)到減毒活疫苗株的感受態(tài)細(xì)胞中得到減毒活疫苗株adh基因缺失標(biāo)記株。
　　 試驗(yàn)2布魯氏菌adh基因缺失標(biāo)

5、記疫苗株免疫保護(hù)性分析
　　 本部分試驗(yàn)是將上一步得到的布魯氏菌adh基因缺失標(biāo)記疫苗株做保護(hù)力評價(jià)分析。首先比較標(biāo)記疫苗株和原始疫苗株在小鼠脾臟內(nèi)的生存情況:分別用等量的缺失標(biāo)記疫苗株和原始疫苗株接種免疫Balb/C小鼠，比較兩者在小鼠脾臟內(nèi)的生存能力，在免疫后的1周到5周，每周都從免疫小鼠的脾臟分離細(xì)菌，系列稀釋后涂板計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示缺失標(biāo)記疫苗株能在小鼠脾臟內(nèi)存活，與原始疫苗株相比，分離出來的缺失標(biāo)記株少，這表明標(biāo)記疫苗株的

6、毒力有所下降，但仍能在小鼠體內(nèi)生存;其次比較標(biāo)記疫苗株和野生疫苗株對小鼠的保護(hù)力:分別用等量的標(biāo)記疫苗株和原始疫苗株免疫Balb/C小鼠，在免疫后5周攻毒同等量的16M，在攻毒后2周，4周，6周分別從攻毒小鼠的脾臟分離細(xì)菌，系列稀釋后涂板計(jì)數(shù)，結(jié)果表示標(biāo)記疫苗株組比原始疫苗株組分離出來的細(xì)菌數(shù)多，但差異不顯著（P＞0.05），可參考在臨床上作為疫苗株使用。
　　 試驗(yàn)3布魯氏菌adh基因的蛋白表達(dá)純化
　　 本部分試驗(yàn)是

7、通過原核系統(tǒng)將布魯氏菌adh基因表達(dá)成蛋白。由于實(shí)驗(yàn)室的前期工作，已經(jīng)將adh基因載入到了大腸桿菌2566中，所以這部分試驗(yàn)只需要將adh蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化。將構(gòu)建好的表達(dá)載體接到液體培養(yǎng)基LB(LuriabertanimediumLB)中，等其生長到對數(shù)期，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-ThiogalactopyranosideIPTG)低溫低轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)蛋白。待誘導(dǎo)完成后，收集并超聲裂解菌體，讓其釋放

8、出蛋白，將菌體蛋白十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS-PAGE），考馬斯亮藍(lán)染色確定目的蛋白成功表達(dá)。將收集的菌體蛋白重新SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的道爾頓大小切下對應(yīng)的條帶，搗碎加入蛋白浸出液，4℃過夜析出蛋白，測濃度并SDS-PAGE驗(yàn)證。結(jié)果表明成功誘導(dǎo)表達(dá)純化了adh蛋白，為下步試驗(yàn)提供了抗原。
　　

9、 試驗(yàn)4布魯氏菌adh基因缺失標(biāo)記疫苗株與野生株、原始疫苗株的鑒別診斷
　　 本部分試驗(yàn)研究主要是通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA)區(qū)分缺失標(biāo)記株和野生株、原始疫苗株。缺失標(biāo)記疫苗株缺失adh基因，不能表達(dá)adh抗原。用缺失標(biāo)記株免疫小鼠后，不能使小鼠產(chǎn)生adh抗原的抗體。在本試驗(yàn)中，用等量的缺失標(biāo)記株、原始疫苗株和野生毒株免疫小鼠，在免疫后1周，2周，4周分別給免疫小