腮腺炎減毒活疫苗病毒的抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　以腮腺炎減毒活疫苗病毒作為溶瘤病毒，研究其對腫瘤的抑制效果，分析其抗腫瘤的作用機制，為腫瘤治療探索新思路。
　　研究方法:
　　本文采用腮腺炎減毒活疫苗病毒（杭州市疾病控制中心）、小鼠胃癌細胞系(MFC)和人腎母細胞瘤細胞系(G401)開展研究。實驗主要分為3組，分別是腮腺炎減毒活疫苗病毒原液組、腮腺炎病毒原液*10-1組(即病毒滴度為原液組的1/10)和無病毒的對照組。
　　1.采用Vero細胞

2、體外擴增病毒，收集腮腺炎減毒活疫苗病毒;利用空斑形成單位PFU法，測定病毒滴度。
　　2.96孔細胞培養(yǎng)板內接種細胞，采用CCK-8檢測腮腺炎減毒活疫苗病毒原液組對MFC、G401腫瘤細胞的抑制作用。
　　3.通過FITC AnnexinⅤ/PI-流式細胞方法，在腮腺炎減毒活疫苗病毒誘導下，連續(xù)3天觀察MFC、G401腫瘤細胞的凋亡率變化。
　　4.獲取腮腺炎減毒活疫苗病毒感染3天后的MFC、G401腫瘤細胞，提取DN

3、A全基因，進行DNA電泳，明確DNA Ladder凋亡小體的形成。
　　5.提取腮腺炎病毒感染3天后的MFC、G401腫瘤細胞蛋白，進行Western Blot蛋白電泳，檢測自噬相關蛋白P62、LC3(LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ)變化趨勢。
　　6.初步開展在體實驗，向小鼠前肢腋下注射MFC小鼠胃癌腫瘤細胞，建立小鼠胃癌荷瘤動物模型。實體腫瘤形成后，分組注射高劑量、低劑量腮腺炎病毒和PBS對照量，觀察腮腺炎病毒對小鼠實體腫瘤增長

4、的抑制作用。
　　研究結果:
　　1.以Vero細胞作為腮腺炎減毒活疫苗病毒生長的宿主，成功提取大批腮腺炎減毒活疫苗病毒。采用空斑形成單位PFU方法，明確了提取的腮腺炎病毒滴度，純化后可進一步提高滴度。
　　2.腮腺炎減毒活疫苗病毒較之于麻疹、水痘等疫苗病毒，對MFC小鼠胃癌細胞和G401人腎母細胞瘤有更強的抑制率，分別達到58.31％和49.52％，說明腮腺炎病毒對這兩種腫瘤細胞均有殺傷作用。
　　3.MFC、

5、G401兩類腫瘤細胞感染腮腺炎減毒活疫苗病毒后，隨時間推移，其形態(tài)學發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細胞稀疏，間隙增大，細胞狹長，細胞內有黃褐色顆粒堆積，細胞核消失呈碎片狀，細胞膜溶解，可見殘渣，最終死亡。
　　4.腮腺炎減毒活疫苗病毒誘導下的MFC細胞凋亡增加。連續(xù)3天腮腺炎減毒活疫苗病毒原液組、*10-1組和對照組的流式細胞分析，凋亡率分別為3.98％、3.44％和2.16％(24h);21.2％、2.72％和2.39％(48h);51.

6、0％、4.63％和2.12％(72h)。另外，MFC感染腮腺炎病毒后出現(xiàn)DNA Ladder，也提示MFC細胞出現(xiàn)凋亡。說明腮腺炎病毒對MFC的殺傷作用主要是通過細胞凋亡程序進行的。
　　5.腮腺炎減毒活疫苗病毒誘導下的G401細胞自噬增加。Western Blot蛋白電泳提示P62下降，LC3和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，表明G401腫瘤細胞在腮腺炎病毒誘導下發(fā)生自噬。說明腮腺炎病毒對G401的殺傷作用主要是通過細胞自噬程序進行

7、的。
　　6.基本建成腫瘤小鼠模型，成瘤率達85.71％。初步實驗發(fā)現(xiàn)腮腺炎減毒活疫苗病毒能夠抑制荷瘤小鼠體積增加。
　　結論:
　　1.腮腺炎減毒活疫苗病毒在體外可以有效抑制腫瘤細胞(MFC、G401)的增殖，促進腫瘤細胞變形、稀疏，直至死亡。
　　2.腮腺炎減毒活疫苗病毒促進不同腫瘤細胞死亡的機制不同。小鼠胃癌細胞MFC主要通過激活凋亡程序，而人腎母細胞瘤G401主要是啟動自噬程序。
　　3.腮腺炎減毒