腮腺炎減毒活疫苗病毒的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　以腮腺炎減毒活疫苗病毒作為溶瘤病毒，研究其對(duì)腫瘤的抑制效果，分析其抗腫瘤的作用機(jī)制，為腫瘤治療探索新思路。
　　研究方法:
　　本文采用腮腺炎減毒活疫苗病毒（杭州市疾病控制中心）、小鼠胃癌細(xì)胞系(MFC)和人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(G401)開(kāi)展研究。實(shí)驗(yàn)主要分為3組，分別是腮腺炎減毒活疫苗病毒原液組、腮腺炎病毒原液*10-1組(即病毒滴度為原液組的1/10)和無(wú)病毒的對(duì)照組。
　　1.采用Vero細(xì)胞

2、體外擴(kuò)增病毒，收集腮腺炎減毒活疫苗病毒;利用空斑形成單位PFU法，測(cè)定病毒滴度。
　　2.96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，采用CCK-8檢測(cè)腮腺炎減毒活疫苗病毒原液組對(duì)MFC、G401腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
　　3.通過(guò)FITC AnnexinⅤ/PI-流式細(xì)胞方法，在腮腺炎減毒活疫苗病毒誘導(dǎo)下，連續(xù)3天觀察MFC、G401腫瘤細(xì)胞的凋亡率變化。
　　4.獲取腮腺炎減毒活疫苗病毒感染3天后的MFC、G401腫瘤細(xì)胞，提取DN

3、A全基因，進(jìn)行DNA電泳，明確DNA Ladder凋亡小體的形成。
　　5.提取腮腺炎病毒感染3天后的MFC、G401腫瘤細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blot蛋白電泳，檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白P62、LC3(LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ)變化趨勢(shì)。
　　6.初步開(kāi)展在體實(shí)驗(yàn)，向小鼠前肢腋下注射MFC小鼠胃癌腫瘤細(xì)胞，建立小鼠胃癌荷瘤動(dòng)物模型。實(shí)體腫瘤形成后，分組注射高劑量、低劑量腮腺炎病毒和PBS對(duì)照量，觀察腮腺炎病毒對(duì)小鼠實(shí)體腫瘤增長(zhǎng)

4、的抑制作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.以Vero細(xì)胞作為腮腺炎減毒活疫苗病毒生長(zhǎng)的宿主，成功提取大批腮腺炎減毒活疫苗病毒。采用空斑形成單位PFU方法，明確了提取的腮腺炎病毒滴度，純化后可進(jìn)一步提高滴度。
　　2.腮腺炎減毒活疫苗病毒較之于麻疹、水痘等疫苗病毒，對(duì)MFC小鼠胃癌細(xì)胞和G401人腎母細(xì)胞瘤有更強(qiáng)的抑制率，分別達(dá)到58.31％和49.52％，說(shuō)明腮腺炎病毒對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用。
　　3.MFC、

5、G401兩類(lèi)腫瘤細(xì)胞感染腮腺炎減毒活疫苗病毒后，隨時(shí)間推移，其形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞稀疏，間隙增大，細(xì)胞狹長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)有黃褐色顆粒堆積，細(xì)胞核消失呈碎片狀，細(xì)胞膜溶解，可見(jiàn)殘?jiān)?，最終死亡。
　　4.腮腺炎減毒活疫苗病毒誘導(dǎo)下的MFC細(xì)胞凋亡增加。連續(xù)3天腮腺炎減毒活疫苗病毒原液組、*10-1組和對(duì)照組的流式細(xì)胞分析，凋亡率分別為3.98％、3.44％和2.16％(24h);21.2％、2.72％和2.39％(48h);51.

6、0％、4.63％和2.12％(72h)。另外，MFC感染腮腺炎病毒后出現(xiàn)DNA Ladder，也提示MFC細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。說(shuō)明腮腺炎病毒對(duì)MFC的殺傷作用主要是通過(guò)細(xì)胞凋亡程序進(jìn)行的。
　　5.腮腺炎減毒活疫苗病毒誘導(dǎo)下的G401細(xì)胞自噬增加。Western Blot蛋白電泳提示P62下降，LC3和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，表明G401腫瘤細(xì)胞在腮腺炎病毒誘導(dǎo)下發(fā)生自噬。說(shuō)明腮腺炎病毒對(duì)G401的殺傷作用主要是通過(guò)細(xì)胞自噬程序進(jìn)行

7、的。
　　6.基本建成腫瘤小鼠模型，成瘤率達(dá)85.71％。初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腮腺炎減毒活疫苗病毒能夠抑制荷瘤小鼠體積增加。
　　結(jié)論:
　　1.腮腺炎減毒活疫苗病毒在體外可以有效抑制腫瘤細(xì)胞(MFC、G401)的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞變形、稀疏，直至死亡。
　　2.腮腺炎減毒活疫苗病毒促進(jìn)不同腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制不同。小鼠胃癌細(xì)胞MFC主要通過(guò)激活凋亡程序，而人腎母細(xì)胞瘤G401主要是啟動(dòng)自噬程序。
　　3.腮腺炎減毒