ZHY抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究ZHY水溶液及其乙醇提取物的抗腫瘤作用，初步探討ZHY乙醇提取物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并就ZHY水溶液的免疫調(diào)節(jié)功能作初步研究，以提供一種新的抗腫瘤藥物來(lái)源。
　　 方法：
　　 ①ZHY水溶液及其乙醇提取物抗腫瘤作用研究：采用動(dòng)物移植性腫瘤模型觀察受試物對(duì)小鼠Lewis肺癌、H22肝癌、S180肉瘤生長(zhǎng)的影響，驗(yàn)證ZHY水溶液及其乙醇提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性；采用MTT法、集落形成實(shí)驗(yàn)、生長(zhǎng)曲線法觀察ZHY乙

2、醇提取物對(duì)多種體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　 ②ZHY乙醇提取物誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞、K562細(xì)胞凋亡的研究：采用3H-TdR摻入法觀察ZHY乙醇提取物對(duì)Bel-7402細(xì)胞DNA合成的影響；利用Hoechst33342熒光染色觀察受試物對(duì)Bel-7402細(xì)胞、K562細(xì)胞形態(tài)的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察受試物對(duì)Bel-7402和K562細(xì)胞凋亡百分比及細(xì)胞周期的影響；提取小分子DNA觀察受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株DNA片斷形

3、成的影響；采用免疫印跡法觀察受試物對(duì)細(xì)胞中P53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響；采用RT PCR法觀察受試物對(duì)Bel-7402細(xì)胞、K562細(xì)胞中p53、bcl-2、bcl-xl、bad、bax mRNA表達(dá)的影響。
　　 ③ZHY水溶液免疫調(diào)節(jié)活性研究：采用正常小鼠模型、環(huán)磷酰胺免疫抑制模型、腫瘤接種免疫抑制模型觀察ZHY水溶液對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。觀察指標(biāo)包括動(dòng)物體重變化、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、外周血血清溶血

4、素生成能力、脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群分布及其在ConA、LPS誘導(dǎo)下分泌IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的能力。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴ZHY水溶液及其乙醇提取物的抗腫瘤活性研究。ZHY水溶液可有效抑制動(dòng)物移植性腫瘤小鼠Lewis肺癌、H22肝癌、S180肉瘤的生長(zhǎng)，并具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系和良好的可重復(fù)性。500mg/kg ZHY水溶液連續(xù)給藥10次，其腫瘤抑制率為43％～48％。
　　 ZHY乙醇提取物

5、對(duì)S180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用與同等生藥劑量的ZHY水溶液生藥混懸液無(wú)明顯差異，且該作用具有良好的可重復(fù)性，提示ZHY乙醇提取物中包含了ZHY水溶液主要抗腫瘤活性成分，ZHY乙醇提取物可代表ZHY水溶液生藥的抗腫瘤活性?？紤]到受試物的溶解度，體外實(shí)驗(yàn)選用ZHY乙醇提取物作為受試對(duì)象。以MTT法和集落形成法測(cè)定ZHY乙醇提取物對(duì)不同類型腫瘤細(xì)胞的殺傷或生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明ZHY乙醇提取物可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，具有廣譜抗腫瘤活性；其IC

6、50值在20～50mg/L之間。生長(zhǎng)曲線法測(cè)定結(jié)果表明，ZHY乙醇提取物可明顯抑制Bel-7402、K562的增殖，但對(duì)達(dá)峰時(shí)間影響不明顯。
　　 ⑵ZHY乙醇提取物誘導(dǎo)Bel-7402、K562細(xì)胞凋亡的研究。Hoechest33342熒光染色形態(tài)觀察結(jié)果顯示，隨著受試物劑量的增高，各受試物組出現(xiàn)的核亮染細(xì)胞百分比增高，且細(xì)胞染色質(zhì)凝聚，并逐漸斷裂形成核碎片，在200、300mg/L*6h ZHY乙醇提取物組可見(jiàn)到明顯的核斷裂

7、和凋亡小體。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，隨受試物濃度增高，凋亡細(xì)胞百分比增加，300mg/L組可見(jiàn)明顯的凋亡峰；但是ZHY乙醇提取物對(duì)Bel-7402細(xì)胞、K562細(xì)胞的增殖周期無(wú)明顯影響。小分子量DNA電泳發(fā)現(xiàn)在高濃度組出現(xiàn)典型的DNA階梯狀電泳條帶。表明，ZHY乙醇提取物能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞Bel-7402、K562凋亡。Western Blot試驗(yàn)結(jié)果表明，該受試物能上調(diào)P53蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。RT PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)受試物可

8、促進(jìn)p53、bad和bax mRNA的表達(dá)，抑制bcl-2，bcl-x1 mRNA的表達(dá)，顯著下調(diào)bcl-2/bax和bcl-xl/bad的相對(duì)比值。推論調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)可能是該受試物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。
　　 ⑶ZHY水溶液對(duì)機(jī)體免疫功能影響的研究。不同劑量ZHY水溶液連續(xù)給藥20天對(duì)正常小鼠的體重?zé)o明顯影響；隨受試物劑量增加，小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、由ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能、外周血血清溶血素生成

9、能力有增加趨勢(shì)，但除外周血血清溶血素生成能力與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異外，其他各組指標(biāo)數(shù)據(jù)與空白對(duì)照組之間的差異不顯著。ZHY水溶液可改善注射環(huán)磷酰胺所引起的小鼠胸腺指數(shù)降低、由ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力下降、外周血血清溶血素生成能力減弱、脾淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的百分含量和CD4/CD8比值下降的狀況，但對(duì)小鼠體重下降、脾臟腫大以及脾淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞的百分含量降低無(wú)明顯影響。ZHY水溶液可減輕腫瘤接種引起的

10、小鼠脾臟腫大，提高腫瘤接種免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞由ConA和LPS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和增殖能力，提高荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+細(xì)胞的百分含量，且CD8+細(xì)胞百分比增長(zhǎng)幅度大于CD4+細(xì)胞，導(dǎo)致CD4/CD8比值下降。受試物可促進(jìn)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞由ConA誘導(dǎo)的IL-2、IL-6、IFN-γ的分泌以及LPS誘導(dǎo)的TNF-α的分泌。但受試物對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)減少、胸腺指數(shù)降低狀況無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：以上研究結(jié)果表明，ZHY水溶