土槿乙酸抗腫瘤作用機(jī)制的研究.pdf

1、土槿乙酸是從松科植物金錢松根皮中分離的新型二萜酸化合物，具有抗真菌、抗生育、抗血管生成和抗腫瘤等作用。近年來研究證實(shí)土槿乙酸對肝癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤活性，且多與p53蛋白表達(dá)相關(guān)，但確切的作用機(jī)制目前仍未清楚。
　　 本文擬以表達(dá)野生型p53和突變型p53的腫瘤細(xì)胞為研究對象，探討土槿乙酸的抗腫瘤作用機(jī)制。因消化道腫瘤（胃癌，肝癌和結(jié)腸癌）屬于易發(fā)生p53突變的惡性腫瘤，而黑色素瘤常常表達(dá)野

2、生型p53，很少發(fā)生p53的突變，故選擇這兩類具有代表性和普遍性的人腫瘤細(xì)胞系作為研究的對象。首先檢測了土槿乙酸對不同人腫瘤細(xì)胞系的抑瘤作用，然后選擇敏感性高且具有代表性的人胃癌MGC803（突變型p53）、AGS（野生型p53）和黑色素瘤SK-28（野生型p53）細(xì)胞株作為研究對象，系統(tǒng)研究了土槿乙酸抗腫瘤作用的機(jī)制，為土槿乙酸可能成為新型抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　 第一部分土槿乙酸對不同人腫瘤細(xì)胞系的抑瘤作用<

3、br>　　 目的：檢測土槿乙酸對不同人腫瘤細(xì)胞系的抑瘤作用，篩選出對土槿乙酸敏感且具有代表性的細(xì)胞系，作為土槿乙酸抗腫瘤作用機(jī)制研究的細(xì)胞模型。
　　 方法：采用四唑氮藍(lán)還原法（MTT）檢測土槿乙酸對人胃癌MGC803、AGS、肝癌SMMC7721、結(jié)腸癌LOVO、人黑色素瘤A375、SK-28和624mel細(xì)胞增殖的抑制作用。運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測PPARγ在人胃癌MGC803、肝癌SMMC7721

4、、結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.土槿乙酸對人胃癌MGC803、AGS、肝癌SMMC7721細(xì)胞抑制作用顯著，且呈時間和劑量依賴性，IC50值分別為AGS（0.89μmol/L）　　 2.土槿乙酸對人黑色素瘤A375，SK-28和624mel細(xì)胞抑制作用顯著，且呈時間和劑量

5、依賴性，IC50值分別為SK～28（1.12μmol/L）　　 3.PPARγ在人消化道腫瘤細(xì)胞株MGC803、SMMC7721、LOVO中均有表達(dá)，這對土槿乙酸發(fā)揮抗腫瘤作用可能是必要的。
　　 小結(jié)：土槿乙酸對表達(dá)野生型和突變型p53的腫瘤細(xì)胞均具有明顯的生長抑制作用，提示土槿乙酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，有望成為一種新的腫瘤治療藥物。
　

6、　 第二部分土槿乙酸對p53野生型和突變型人胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制的對比研究
　　 目的：對比研究土槿乙酸對人胃癌MGC803和AGS細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析檢測細(xì)胞凋亡的改變；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化；應(yīng)用蛋白檢測和RT-PCR技術(shù)檢測參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期運(yùn)行的相關(guān)基因的蛋白和mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：

7、r>　　 1.Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析證實(shí)，土槿乙酸明顯誘導(dǎo)人胃癌AGS、MGC803細(xì)胞凋亡產(chǎn)生；
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，土槿乙酸誘導(dǎo)人胃癌AGS、MGC803細(xì)胞G2期阻遏；
　　 3.10μmol/L土槿乙酸作用AGS細(xì)胞12h后可見p53表達(dá)增加，在36h達(dá)到峰值，24h后可見p21WAF1/CIP1表達(dá)明顯增加；作用MGC803細(xì)胞12h后明顯上調(diào)PPAR7mRN

8、A表達(dá)，24h后可見p21WAF1/CIP1表達(dá)明顯增加；
　　 4.土槿乙酸作用于AGS、MGC803細(xì)胞后，增加了Fas/APO-1蛋白表達(dá)和促凋亡蛋白BaxmRNA表達(dá)，降低了抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表達(dá)，提高了caspase-3活性。
　　 小結(jié)：
　　 1.土槿乙酸能明顯誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯；
　　 2.土槿乙酸通過Bcl-2介導(dǎo)的線粒體途徑和Fas/APO-1介導(dǎo)的死亡受體途

9、徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；
　　 3.p53野生型的胃癌細(xì)胞，其凋亡途徑的激活可能與p53表達(dá)有關(guān)；p53突變型的胃癌細(xì)胞，其凋亡途徑的激活可能與PPAR7表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分土槿乙酸對p53野生型人黑色素瘤細(xì)胞抗增殖作用機(jī)理的研究
　　 目的：研究土槿乙酸抗人黑色素瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　 方法：采用Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的改變；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析

10、細(xì)胞周期的變化；運(yùn)用Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期運(yùn)行的相關(guān)基因的蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析證實(shí)土槿乙酸能明顯誘導(dǎo)人黑色素瘤SK-28細(xì)胞凋亡產(chǎn)生；
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)分析顯示土槿乙酸誘導(dǎo)人黑色素瘤SK-28細(xì)胞G2/M期阻遏：（1）土槿乙酸作用SK-28細(xì)胞4h，增加了Cdc2的磷酸化水平，

11、24 h下調(diào)了其蛋白水平表達(dá)。（2）土槿乙酸降低了Cdc25C磷酸酶蛋白表達(dá)，提高了Weel激酶蛋白表達(dá)。（3）土槿乙酸能明顯誘導(dǎo)p53下游靶基因p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)，降低Cdc2的活性。（4）土槿乙酸增加了ATM激酶活性，提高了細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶Chk2和p53蛋白表達(dá)及p53磷酸化水平，這些作用可被ATM激酶抑制劑咖啡因阻斷；
　　 3.土槿乙酸作用于SK-28細(xì)胞后，增加了Fas/APO-1蛋白表達(dá)和促凋亡蛋白

12、Bax mRNA表達(dá)，降低了抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表達(dá)；提高了caspase-3活性。
　　 小結(jié)：
　　 1.土槿乙酸可通過依賴ATM-p53-p21WAF1/CIP1信號途徑和ATM-Chk2-Cdc25C信號途徑誘導(dǎo)人黑色素瘤SK-28細(xì)胞周期G2/M期阻滯。
　　 2.土槿乙酸可通過Bcl-2介導(dǎo)的線粒體途徑和Fas/APO-1介導(dǎo)的死亡受體途徑誘導(dǎo)人黑色素瘤SK-28細(xì)胞凋亡。
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13、.凋亡途徑的激活可能與p53表達(dá)有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.土槿乙酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，有望成為一種新的抗腫瘤藥物；
　　 2.土槿乙酸可通過Bcl-2介導(dǎo)的線粒體途徑和Fas/APO-1介導(dǎo)的死亡受體途徑誘導(dǎo)人胃癌和黑色素瘤細(xì)胞凋亡，提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是土槿乙酸抗癌作用的機(jī)制之一；
　　 3.土槿乙酸可通過依賴ATM-p53-p21WAF1/CIP1信號途徑和ATM-Chk2-Cdc25C信號途