虎杖苷抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，由于人口增長(zhǎng)、老齡化和不良生活習(xí)慣的影響，近年來在全世界范圍內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升。惡性腫瘤已成為發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的首位死因。乳腺癌是世界各地女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性新發(fā)惡性腫瘤的23%，具有發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)、病程進(jìn)展緩慢等特點(diǎn)。肺癌則是男性中最常見的惡性腫瘤，是男性癌性死亡的首位原因，女性癌性死亡的第二大腫瘤。
　　目前對(duì)于惡性腫瘤的主要治療方法包括：手術(shù)，放射治療，化療

2、和分子靶向治療。化療在惡性腫瘤治療中仍處于基礎(chǔ)地位，但目前臨床上廣泛使用的化療藥物療效有限，毒性作用較大，經(jīng)幾次應(yīng)用后還會(huì)發(fā)生耐藥。近年來，采用傳統(tǒng)中藥等植物提取物探討惡性腫瘤治療的新途徑引起了人們的關(guān)注，從傳統(tǒng)中藥提取的抗腫瘤藥物如冬凌草甲素、黃連素、姜黃素的體外實(shí)驗(yàn)表明可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，從植物中提取的紫杉醇、喜樹堿、長(zhǎng)春新堿等藥物已在臨床上廣泛應(yīng)用。因此篩選新型抗腫瘤的植物藥，確定其抗腫瘤作用并探討其機(jī)制，已成為當(dāng)今腫瘤治療

3、研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
　　虎杖苷是從虎杖的干燥根莖中提取的第4種單體，又名白藜蘆醇苷，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明虎杖苷對(duì)心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等有顯著作用，此外還能減輕多種因素造成的組織器官損傷，具有保護(hù)肝細(xì)胞，降血脂及抗脂質(zhì)過氧化等作用。而對(duì)其抗腫瘤作用的研究報(bào)道仍較少，本課題是研究虎杖苷在乳腺癌細(xì)胞、肺癌中的生物學(xué)功能以及相關(guān)機(jī)制，旨為進(jìn)一步開展虎杖苷抗腫瘤作用的基礎(chǔ)和臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本課題

4、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要分為五部分：
　　第一部分虎杖苷對(duì)惡性腫瘤增殖抑制效應(yīng)的研究
　　目的：
　　研究虎杖苷在體內(nèi)外對(duì)乳腺癌、肺癌生長(zhǎng)的影響，并觀察其對(duì)正常細(xì)胞的毒性和在體內(nèi)的對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒副作用。
　　方法：
　　應(yīng)用MTT或CCK8法檢測(cè)虎杖苷對(duì)10種不同來源的惡性腫瘤細(xì)胞及兩種正常上皮細(xì)胞生存曲線的影響并比較了虎杖苷和白藜蘆醇抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效力。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析虎杖苷對(duì)乳腺癌及肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期變化的影

5、響及凋亡誘導(dǎo)情況。采用人肺癌細(xì)胞皮下移植動(dòng)物模型觀察虎杖苷對(duì)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響及其毒副作用。
　　結(jié)果：
　　虎杖苷對(duì)10種不同來源的惡性腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231，肺癌 A549、NCI-H1975、宮頸癌 Hela、卵巢癌 SKOV-3、肝癌 SM7721、鼻咽癌CNE-1，白血病HL-60及K562細(xì)胞均具有明顯的抑制其生長(zhǎng)的作用，且生長(zhǎng)抑制作用呈劑量和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系?；⒄溶諏?duì)正常乳腺上皮細(xì)

6、胞 MCF-10A及肺支氣管上皮細(xì)胞HBE的毒性作用小于相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞。虎杖苷對(duì)乳腺癌及肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于其糖配基白藜蘆醇。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示虎杖苷可引起腫瘤細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期進(jìn)程的 S期，虎杖苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示虎杖苷可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)且未見明顯毒副反應(yīng)。
　　第二部分虎杖苷抗腫瘤作用的分子機(jī)制研究
　　目的：
　　研究虎杖苷抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、引起細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋

7、亡的分子機(jī)制。
　　方法：
　　采用人磷酸化激酶蛋白芯片及凋亡相關(guān)蛋白芯片檢測(cè)經(jīng)虎杖苷處理的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)磷酸化激酶及凋亡相關(guān)蛋白的變化。應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和檢測(cè)與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化。應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PI3K、Erk、JNK、P38抑制劑對(duì)虎杖苷抗腫瘤作用的影響。
　　結(jié)果：
　　虎杖苷處理后的乳腺癌細(xì)胞內(nèi) CREB的活性受到抑制，且抑制作用在虎杖苷作用后2

8、小時(shí)即發(fā)生并一直持續(xù)至40小時(shí)。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)在虎杖苷處理后的乳腺癌及肺癌細(xì)胞表達(dá)明顯下降?；⒄溶仗幚砗蟮娜橄侔┘?xì)胞內(nèi)源性和外源性凋亡途徑均被激活。PI3K、Erk、JNK、P38抑制劑對(duì)虎杖苷抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、引起細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用無明顯影響。
　　第三部分虎杖苷對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制研究
　　目的：
　　研究虎杖苷對(duì)如乳腺癌及肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲的影響，并對(duì)其分子機(jī)

9、制進(jìn)行初步探討。
　　方法：
　　應(yīng)用傷口愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察虎杖苷對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。應(yīng)用腫瘤細(xì)胞粘壁實(shí)驗(yàn)觀察虎杖苷對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附能力的影響。采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察虎杖苷對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　傷口愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示虎杖苷可抑制乳腺癌及肺癌細(xì)胞的遷移，粘壁

10、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示虎杖苷可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的粘附能力， Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示虎杖苷可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)虎杖苷處理后的乳腺癌細(xì)胞 E-cadherin、b-catenin的表達(dá)上調(diào)，N-cadherin的表達(dá)下調(diào)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)無明顯變化。
　　第四部分虎杖苷對(duì)阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用研究
　　目的：
　　研究虎杖苷

11、對(duì)乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞 MCF-7/ADR增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，并初步探討其分子機(jī)制。
　　方法：
　　應(yīng)用MTT法檢測(cè)虎杖苷對(duì)乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADR的生存曲線的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)虎杖苷處理MCF-7/ADR細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化和凋亡發(fā)生率，應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)虎杖苷對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　MCF-7/ADR細(xì)胞除了對(duì)阿霉素

12、耐藥外還對(duì)吉西他濱和紫杉醇耐受，虎杖苷可抑制MCF-7/ADR的生長(zhǎng)且其抑制作用與MCF-7細(xì)胞相比無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示虎杖苷引起MCF-7/ADR細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，虎杖苷誘導(dǎo)MCF-7/ADR細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)呈劑量依賴。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示虎杖苷處理的MCF-7/ADR細(xì)胞Bcl-2、CyclinD1及NF-kB表達(dá)下降、Bax及Cleaved-PARP表達(dá)上調(diào)。
　　第五部分

13、虎杖苷對(duì)晚期炎癥因子HMGB1影響的研究
　　目的：
　　研究虎杖苷對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞后晚期炎癥因子HMGB1及多種早期炎癥因子釋放的影響。
　　方法：
　　應(yīng)用 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)虎杖苷及白藜蘆醇對(duì) LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的HMGB1的影響，應(yīng)用Griess法檢測(cè)虎杖苷對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO的影響，應(yīng)用細(xì)胞因子芯片檢測(cè)虎杖苷及白藜蘆醇對(duì) LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多種早期炎癥因子的影響。<

14、br>　　結(jié)果：
　　LPS刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞釋放大量HMGB1，虎杖苷在0.06和0.12mmol/L的劑量范圍內(nèi)則可減少LPS所引起的HMGB1的釋放,白藜蘆醇在0.5-2.5mmol/L的劑量范圍內(nèi)可抑制LPS誘導(dǎo)的HMGB1的釋放?；⒄溶諏?duì)LPS所引起的NO的釋放無明顯影響。細(xì)胞因子芯片的結(jié)果顯示，虎杖苷及白藜蘆醇在可抑制 HMGB釋放的濃度范圍內(nèi)對(duì)62種早期炎癥因子無明顯影響。
　　結(jié)論
　　(1)虎杖苷具

15、有廣譜的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且虎杖苷在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，虎杖苷可抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)并對(duì)動(dòng)物無明顯毒副作用。虎杖苷通過導(dǎo)致細(xì)胞周期 S期阻滯及誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。虎杖苷抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、引起細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制CREB的活性，下調(diào)Cyclin D1，激活內(nèi)外源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)?；⒄溶湛鼓[瘤作用與PI3K/AKT及MAPK信號(hào)通路及NF-kB無關(guān)。
　

16、　(2)在不明顯影響細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度下，虎杖苷在體外可抑制乳腺癌和肺癌細(xì)胞的貼壁能力、遷移和侵襲能力，其抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制可能與上調(diào)E-cadherin、b-catenin蛋白，下調(diào)N-cadherin蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　(3)虎杖苷對(duì)乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞仍具有增殖抑制作用，導(dǎo)致乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR細(xì)胞細(xì)胞周期G0/G1期阻滯及發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能上調(diào)Bax蛋白、激活PARP，下調(diào)Bcl-2及NF-kB蛋白的表達(dá)有