仙客來(lái)皂苷體外協(xié)同5-FU抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究仙客來(lái)皂苷(Cyclamin)單用或聯(lián)合5-Fu體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Bel-7402凋亡和壞死的作用及其分子機(jī)制。
　　方法:采用MTT比色法檢測(cè)Cyclamin單用及聯(lián)合5-Fu對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的增值抑制作用;采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和體外侵襲小室試驗(yàn)證明Cyclamin抑制腫瘤Bel-7402細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移;采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別觀察常規(guī)化療藥物單用及聯(lián)合Cyclamin處理Bel-7402細(xì)胞24小時(shí)和48

2、小時(shí)后，對(duì)其細(xì)胞周期和凋亡變化的影響;進(jìn)一步用免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)Cyclamin與5-Fu聯(lián)用，對(duì)周期調(diào)控蛋白CDK2、CyclinA、CDC25A和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:Cyclamin抑制人肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間-劑量相關(guān)性;24h和48h時(shí)合用組（1.25μM Cyclamin+80μM 5-Fu）的抑制率分別為34.58±6.7％和54.88

3、±5.5％，與5-Fu(80uM)單用時(shí)的體外生長(zhǎng)抑制率30.98±9.6％、40.67±10.7％(24h、48h)比較有顯著提高;聯(lián)合指數(shù)（CI值）小于1。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:對(duì)照組細(xì)胞24h、48h的相對(duì)遷移距離分別為80.1±2.7％和60.2±3.4％;2.5μM的Cyclamin實(shí)驗(yàn)組24h、48h的相對(duì)遷移距離分別為90.8±4.4％和82.1±5.6％，1.25μM的Cyclamin實(shí)驗(yàn)組48h的相對(duì)遷移距離是79.7±2

4、.9％，與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組遷移距離相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:24h對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為53.33±3.51;1.25μM和2.5μM Cyclamin實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為35.00±1.73、11.33±1.53，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果顯示:Cyclamin（0、1.25、2.5、5μM）處理Bel-7402細(xì)胞24h后，隨著Cyclamin濃度的

5、升高，S期細(xì)胞含量逐漸增多，在5.0μM濃度時(shí)，S期細(xì)胞含量是對(duì)照組的2.03倍，且出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰;5.0μMCyclamin的早、晚期凋亡率分別為7.4％和8.3％，隨Cyclamin劑量增加，壞死細(xì)胞率依次為1.6％、2.7％、3.5％、5.9％，呈劑量相關(guān)性;Cyclamin(1.25μM)與5-Fu(80μM)分別并聯(lián)合處理Bel-7402細(xì)胞，24h合用組S期細(xì)胞含量是52.75％，為對(duì)照組的2.22倍，且協(xié)同增加了

6、5-Fu單用時(shí)的S期細(xì)胞含量(43.66％)。48h合用組S期細(xì)胞含量39.85％，為對(duì)照組的3.28倍，雖然略低于5-Fu單藥組S期細(xì)胞數(shù)41.26％，但僅合用組出現(xiàn)明顯亞二倍體凋亡峰。24h后合用組早期凋亡率為9.9％，比對(duì)照組(0.8％)及5-Fu單藥組(6.2％)明顯提高。48h合用組壞死細(xì)胞率達(dá)15.8％，與對(duì)照組(3.9％)及5-Fu單藥組(4.4％)相比差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Western-blot蛋白免