葉酸修飾的金屬有機(jī)骨架裝載抗腫瘤藥5-FU的基礎(chǔ)研究.pdf

1、金屬-有機(jī)骨架（Metal-OrganicFrameworks，MOFs）是新型的多孔有機(jī)-無機(jī)雜化功能材料。MOFs具有其他材料都無法比擬的結(jié)構(gòu)可裁性和易功能化的特性，由于其豐富的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，相較經(jīng)典的無機(jī)微孔材料，具有更高的比表面積，獨(dú)特的光電磁等性質(zhì)，在儲H2和CO2等氣體選擇吸附方面顯示重要應(yīng)用前景。由于MOFs材料具有的多方面的優(yōu)點(diǎn)，使MOFs的研究得到越來越多的關(guān)注。近年的研究表明，MOFs也顯現(xiàn)出許多作為藥物載體的特質(zhì)，

2、包括:適于包封藥物的高的孔表面積和大的孔徑;金屬與配體間相對不穩(wěn)定的配位鍵從而使MOFs具有的生物可降解性;運(yùn)用合成后修飾手段可使其攜帶多種功能基團(tuán)等。
　　 MOFs通常是在溫和的條件下，通過絡(luò)合作用以自組裝的方式將金屬離子與有機(jī)配體連接而形成。近年，國外學(xué)者（如:Ferey;WenbinLin等）對MOFs作為藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明:MOFs可以同時實(shí)現(xiàn)高載藥量和適宜的藥物控制釋放。例如，在含有Cr3+的MOF

3、s中載入藥物布洛芬，載藥量可達(dá)0.220g/g載體，18d方可釋藥完全，但由于含Cr3+，限制了MOFs在體內(nèi)的應(yīng)用。鑒于人體組織中所含的金屬元素，以Zn2+作為中心金屬合成MOFs比較適宜用作藥物載體的研究。
　　 葉酸是人體必需的維生素，它可參與細(xì)胞生長增殖過程中核苷酸堿基的合成，主要通過葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞，所以葉酸受體在生長旺盛的組織，特別是多種上皮系腫瘤細(xì)胞如卵巢癌、腎癌、子宮癌、睪丸癌、腦瘤、結(jié)腸癌、肺腺癌及口腔上皮

4、癌KB細(xì)胞中高水平表達(dá)。由于葉酸具有無毒、免疫原性弱、穩(wěn)定、與葉酸受體的結(jié)合力強(qiáng)、對腫瘤有高度選擇性特點(diǎn)而成為重要的靶向制劑。大量研究表明，以葉酸受體作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，可增強(qiáng)抗腫瘤的療效，減少對正常組織的損害，并有助于克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
　　 5-氟尿嘧啶(5-FU)為臨床常用的抗代謝類抗腫瘤藥物，主要用于胃、腸和肝等多種癌癥的治療。但本品有較強(qiáng)的毒副作用，MOFs可以同時實(shí)現(xiàn)高載藥量和適宜的藥物控制釋放，可以延長5-FU

5、在體內(nèi)作用的時間和改善5-FU在體內(nèi)半衰期短、毒副作用大等缺點(diǎn)，是抗腫瘤藥良好的載體。但國內(nèi)在這方面的研究尚未見文獻(xiàn)報道。所以本課題在前人研究IRMOF-3的基礎(chǔ)上，將IRMOF-3偶聯(lián)葉酸后，選擇5-FU為模型藥物，考察其體外載藥與釋藥特性，并研究體外細(xì)胞毒性和靶向性特點(diǎn)，為IRMOF-3作為藥物載體的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 目的：
　　 1、采用溶劑熱法制備納米級的金屬有機(jī)骨架Zrn4O(C8H5NO4)3即(IR

6、MOF-3)，并對IRMOF-3進(jìn)行表征
　　 2、運(yùn)用合成后修飾方法將葉酸連接至IRMOF-3表面，得到葉酸偶聯(lián)的金屬有機(jī)骨架(Folicacid-IRMOF-3)(FIR)，并對其偶聯(lián)葉酸的處方工藝進(jìn)行優(yōu)化和對FIR表征分析
　　 3、FIR體外載藥和釋藥的研究
　　 4、載藥的FIR體外細(xì)胞毒性的研究和細(xì)胞靶向性的評價
　　 方法和結(jié)果：
　　 1、采用溶劑熱法合成金屬有機(jī)骨架IRMOF-3

7、，并升溫活化去除IRMOF-3中的DMF。選用X-射線粉末衍射(XRD)，紅外光譜(IR)，掃描電鏡(SEM)，熱重分析(TG)對所得樣品進(jìn)行表征分析，測量IRMOF-3粒徑大小，穩(wěn)定性狀況。結(jié)果表明得到的樣品IRMOF-3結(jié)構(gòu)正確，重復(fù)性良好，升溫活化處理可將絕大多數(shù)有機(jī)溶劑DMF除去，IRMOF-3熱穩(wěn)定良好，平均粒徑在200～300nm左右，形狀為圓形或橢圓形且表面光滑完整，分布均勻。
　　 2、利用IRMOF-3中配體上

8、的氨基基團(tuán)與葉酸中羧基基團(tuán)發(fā)生酰胺反應(yīng)得到葉酸偶聯(lián)的IRMOF-3(FIR)。對FIR采用核磁共振H譜(1HNMR)，IR，SEM和MS方法進(jìn)行定性分析，并對其偶聯(lián)葉酸的處方工藝采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化，以偶聯(lián)率為主要考察指標(biāo)，按L16(43)正交表設(shè)計安排試驗(yàn)，比較各因素極差R的大小和K值的大小，確定影響工藝的因素順序和確定最佳工藝處方，從而選出最佳的實(shí)驗(yàn)條件。1HNMR，IR和質(zhì)譜法(MS)的結(jié)果都顯示FIR具有葉酸的化學(xué)位移和特征吸收峰

9、，表明葉酸成功的偶聯(lián)在IRMOF-3上，偶聯(lián)葉酸后的FIR平均粒徑大約為200～300nm左右，且分布均勻，形狀為圓形或者橢圓型，偶聯(lián)葉酸后載體的直徑?jīng)]有顯著的變化。眾多影響因素的主次順序是:葉酸∶載體（質(zhì)量比）＞反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度;最佳處方條件即葉酸和載體的質(zhì)量比為2:1，反應(yīng)時間為2h，反應(yīng)溫度為40℃，這時的葉酸偶聯(lián)率最高0.709g/g載體。
　　 3、按最佳偶聯(lián)條件制備FIR并載入5-FU，以載藥時間，載體和藥物的質(zhì)量

10、比和載藥量為指標(biāo)，并對載藥工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，來確定最佳的載藥條件，體外釋藥實(shí)驗(yàn)觀察藥物體外的釋放效果。結(jié)果顯示隨著5-FU與載體FIR質(zhì)量比的增加，即固定載體的量，增加藥物5-FU的量，F(xiàn)IR的載藥量隨之增加，同時隨著載藥天數(shù)的增加，F(xiàn)IR的裝載量也增加。析因分析結(jié)果顯示:不同的載藥天數(shù)對FIR的載藥量有顯著影響(F=145.398，P=0.000)，不同質(zhì)量比對FIR載藥量的影響也顯著(F=18.167，P=0.000)，載藥天數(shù)和質(zhì)

11、量比之間具有交互效應(yīng)(F=4.499，P=0.001)。同時得出藥物5-FU與FIR質(zhì)量比為2:1時，載藥時間為5d時，藥物容量基本達(dá)到飽和，F(xiàn)IR的載藥量達(dá)到最大。因此得到最優(yōu)的載藥條件為5-FU和FIR質(zhì)量比為2:1，載藥天數(shù)為5d。按照透析袋擴(kuò)散法考察了載有5-FU的FIR的體外釋放效果，所得釋藥曲線顯示，在平穩(wěn)釋放的84h內(nèi)，5-FU的釋放量為55.3％，顯示明顯的緩釋效果。
　　 4、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以無葉酸培養(yǎng)液培養(yǎng)A5

12、49細(xì)胞（葉酸受體不表達(dá)細(xì)胞），Hela細(xì)胞（葉酸受體中表達(dá)細(xì)胞），KB細(xì)胞（葉酸受體高表達(dá)細(xì)胞）常規(guī)傳代后，分別與不同濃度的5-FU組（陽性對照組）、IRMOF-3組、IRMOF-3載有5-FU組(5FU-IR，不接葉酸)、葉酸偶聯(lián)IRMOF-3載有5-FU組(5FU-FIR，接有葉酸)孵化48h后，MTT法測定細(xì)胞存活率。
　　 多重分析結(jié)果顯示在A549、Hela、KB三種細(xì)胞中，IRMOF-3組的細(xì)胞存活率和陽性對照5-

13、FU組細(xì)胞存活率相比都有顯著差異(P值均小0.05)，IRMOF-3組細(xì)胞毒性在同等濃度下小于5-FU組，說明IRMOF-3對細(xì)胞的生長影響較小，生物相容性較好。在三種細(xì)胞中5FU-IR組和5-FU組細(xì)胞存活率相比都無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均大于0.05），這可能是因?yàn)?-FU和5FU-IR進(jìn)入細(xì)胞的方式相同，細(xì)胞毒性相差不大，故細(xì)胞的存活率相比無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 多重分析結(jié)果同時顯示:A549細(xì)胞是葉酸受體不表達(dá)細(xì)胞，5FU-FI

14、R組不能通過葉酸受體進(jìn)入細(xì)胞，和5-FU組進(jìn)入細(xì)胞的方式相同，5FU-FIR組和5-FU組相比細(xì)胞存活率沒有顯著差異(P=0.379)。Hela細(xì)胞為葉酸受體中表達(dá)細(xì)胞，F(xiàn)IR偶聯(lián)葉酸，對葉酸受體表達(dá)細(xì)胞有一定的靶向作用，但是可能是進(jìn)入FIR孔中的5-FU有緩慢釋放的過程，沒有在48h內(nèi)完全釋放出5-FU，所以兩組的細(xì)胞存活率也無顯著差異(P=0.441)。KB細(xì)胞為葉酸受體高表達(dá)細(xì)胞，F(xiàn)IR能大量的通過葉酸受體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，將5-FU

15、快而準(zhǔn)的帶入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞的毒性大大增加，所以5FU-FIR組和5-FU組相比細(xì)胞存活率有顯著差異(P=0.013)。
　　 5、為了評價5FU-FIR的細(xì)胞靶向性，本節(jié)實(shí)驗(yàn)以未經(jīng)葉酸修飾的5FU-IR作為對照，以葉酸受體不同表達(dá)的三種腫瘤細(xì)胞:細(xì)胞表面葉酸受體高表達(dá)的KB細(xì)胞、細(xì)胞表面葉酸受體適度表達(dá)的Hela細(xì)胞，細(xì)胞表面葉酸受體不表達(dá)的細(xì)胞A549作為模型，分別將葉酸，5FU-FIR，5FU-IR與上述細(xì)胞孵化48h，MTT

16、法測定細(xì)胞抑制率，考察葉酸對細(xì)胞生長的影響和研究5FU-FIR腫瘤選擇性。
　　 體外細(xì)胞靶向性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葉酸對此三種細(xì)胞生長沒有顯著影響。5FU-IR組在葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞和不表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞抑制率均不受游離的葉酸的影響，因?yàn)?FU-IR組無偶聯(lián)葉酸，不能通過葉酸受體介導(dǎo)，沒有靶向性，故對游離葉酸不敏感。
　　 在葉酸受體不表達(dá)的A549細(xì)胞中，5FU-FIR不能和葉酸受體結(jié)合，只能全部通過被動的方式被吞入，所以和

17、游離葉酸的濃度無關(guān)，組內(nèi)不同葉酸濃度的細(xì)胞抑制率無顯著差異(F=0.495，P=0.690)。但在Hela和KB細(xì)胞中，很低濃度游離葉酸存在時，極少量的葉酸受體被阻斷，5FU-FIR還能通過剩下的葉酸受體到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，隨著外源性葉酸濃度加大，細(xì)胞中葉酸受體被外源性葉酸慢慢阻斷，最后在高濃度游離葉酸時，葉酸受體被完全阻斷，5FU-FIR只能通過被動方式被吞入，細(xì)胞毒性大大減小，細(xì)胞的抑制率也達(dá)到最低，因此在葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞中，5FU-F

18、IR組組內(nèi)不同葉酸濃度的細(xì)胞抑制率有顯著差異(Hela細(xì)胞中F=14.021，P=0.000，KB細(xì)胞中F=117.204，P=0.000)。
　　 5FU-FIR中偶聯(lián)了葉酸，在葉酸受體表達(dá)的Hela細(xì)胞和KB細(xì)胞的細(xì)胞中，5FU-FIR組可以隨著葉酸受體靶向進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而5FU-IR只能通過內(nèi)吞等其他方式進(jìn)入，細(xì)胞毒性小于5FU-FIR組，而A549細(xì)胞是葉酸受體表達(dá)陰性細(xì)胞，5FU-FIR組與5FU-IR組進(jìn)入細(xì)胞的方式

19、一樣，不能由葉酸受體進(jìn)入細(xì)胞，兩組細(xì)胞抑制率無顯著差異。綜上所述，5FU-FIR具有細(xì)胞靶向性，與葉酸受體有高的親和性，是抗腫瘤藥良好載體。
　　 結(jié)論：
　　 本研究制備的納米級金屬有機(jī)骨架IRMOF-3大小合適，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，電鏡下觀察形狀為圓形或橢圓形，表面光滑且分布均勻。通過核磁共振H譜，紅外光譜法和質(zhì)譜法定性檢測到葉酸成功偶聯(lián)到IRMOF-3上得到FIR，正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)化，得到了葉酸偶聯(lián)的最佳工藝條件。

20、FIR載入5-FU，通過優(yōu)化載藥條件得到具有較高載藥量的FIR，且在體外有較好的緩釋性，可以延長5-FU在體內(nèi)作用的時間和改善5-FU在體內(nèi)半衰期短，毒副作用大等缺點(diǎn)，體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞靶向性試驗(yàn)說明載體IRMOF-3的細(xì)胞毒性在同等藥物濃度下要小于5-FU細(xì)胞毒性，生物相容性好。葉酸偶聯(lián)物5FU-FIR對葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞有靶向作用，是抗腫瘤藥良好的載體。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 金屬有機(jī)骨架IRMOF-3合成簡