CD40配體重組腺病毒聯(lián)合5-Fu抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤的治療目前仍以手術(shù)治療、化療和放療為主，而生物治療與化療相結(jié)合的生物—化療模式是目前綜合治療的發(fā)展方向之一。以免疫細(xì)胞靶向的基因治療策略是當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)。CD40配體(CD40L)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族中較重要的成員之一，與其受體CD40特異性結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CD40L—CD40是一對(duì)重要的共刺激分子，參與機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫、直接殺傷腫瘤細(xì)胞、炎癥等病理反應(yīng)中起重要作用。5-氟尿嘧啶(5-Fu

2、)是干擾腫瘤細(xì)胞RNA功能，阻止腫瘤細(xì)胞DNA合成的抗代謝類藥物。本研究通過構(gòu)建重組CD40L腺病毒聯(lián)合化療藥物5-Fu，觀察在小鼠腹腔腫瘤模型中能否產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步分析。 方法： 1．將小鼠(m)CD40L或人(h)CD40L基因克隆到穿梭載體pShuttle質(zhì)粒中，得到pShuttle-mCD40L和pShuttle-hCD4OL，并分別將其線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸

3、桿菌BJ5183中共轉(zhuǎn)化。 2．將腺病毒質(zhì)粒PacI酶切后，經(jīng)Lipofectamine脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，2周后得到包裝重組腺病毒Ad-mCD40L和Ad-hCD40L，經(jīng)PCR、Westen-blot鑒定后大量擴(kuò)增、純化病毒并測定其感染滴度。 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測重組腺病毒Ad-mCD40L聯(lián)合化療藥5-Fu，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的CT26結(jié)腸腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡。MTT實(shí)驗(yàn)定量分析聯(lián)合處理導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

4、4．建立BALB／C小鼠結(jié)腸癌腹腔腫瘤模型，觀察聯(lián)合處理對(duì)腫瘤生長的影響。通過細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞檢測、ELISA檢測血清中IFN-γ濃度、淋巴細(xì)胞阻斷實(shí)驗(yàn)、腫瘤組織切片等探討抗腫瘤作用的機(jī)制。 結(jié)果： 1．經(jīng)酶切鑒定得到了包含有mCD40L和hCD40L基因的重組穿梭質(zhì)粒載體pShuttle-mCD40L和pShtUttle-hCD40L以及在BJ5183大腸桿菌內(nèi)同源重組的腺病毒質(zhì)粒pAd-mCD40L和pAd-hCD4

5、0L。 2．pAd-mCD40L、pAd-hCD40L轉(zhuǎn)染293細(xì)胞得到包裝的腺病毒，PCR檢測到m CD40L和hCD40L基因特異片段，Western-blot分析顯示一條與預(yù)期蛋白分子量一致的條帶。體外擴(kuò)增純化后得到感染滴度分別是Ad-mCD40L：6.0×10<'10>PFU／m1和Ad-hCD40L：6.5×10<'10>PFU／ml。 3．經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，重組腺病毒Ad-mCD40L聯(lián)合5-Fu處理組比單

6、一處理組能增強(qiáng)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡。MTT實(shí)驗(yàn)定量分析聯(lián)合處理導(dǎo)致明顯增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。 4．在BALB／C小鼠腹腔結(jié)腸腺癌(CT26)動(dòng)物腫瘤模型中，聯(lián)合治療組小鼠的腹腔腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目及大小比單一治療各組明顯少而小，且荷瘤小鼠生存時(shí)間延長。進(jìn)一步研究經(jīng)Ad-mCD40L治療的小鼠的脾T 細(xì)胞在體外能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞。在去除CD8<'+>T淋巴細(xì)胞亞群后，Ad-mCD40L誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)被抑制比去除CD4<'+

7、>T淋巴細(xì)胞要明顯，證實(shí)其抗腫瘤免疫反應(yīng)主要依賴CD8<'+>T淋巴細(xì)胞，部分依賴于CD4<'+>T淋巴細(xì)胞。Ad-mCD40L_治療小鼠血清中IFN-γ濃度明顯高于5-Fu和NS組。Tunnel法檢測和HE染色小鼠腫瘤組織石蠟切片觀察，聯(lián)合組比單一組凋亡細(xì)胞明顯增多，并可見大量腫瘤細(xì)胞壞死。 結(jié)論： 1．通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建了mCD40L和hCD40L分子的重組腺病毒 Ad-naCD40L及Ad-hCD40L，并在體