重組腺病毒介導的RNA干擾對肝腫瘤細胞的干預實驗研究.pdf

1、背景與目的：人肝細胞癌是世界范圍最高發(fā)的惡性腫瘤之一，亞洲和非洲尤其高發(fā)，估計每年有五十萬新發(fā)病人和一百萬死亡病人。肝癌的病因已經(jīng)研究得比較清楚，在中國主要是乙型病毒感染，近年來酒精性肝病有上升趨勢，另外黃曲霉素、糖尿病、代謝性肝病、體重過大等都是危險因素。肝癌是多因素多步驟發(fā)病，涉及多個基因變異最終導致肝細胞惡變。由于肝癌致病原因多樣發(fā)病機制復雜，其確切分子機制至今尚不十分清楚。各種致病因子導致肝細胞反復受損、反復修復，可能導致基因變

2、異，例如細胞癌基因激活、抑癌基因失活、DNA配對錯誤、染色體損傷、生長因子和血管生長因子過度表達等。肝癌與肝硬化關系密切，70—90﹪的肝癌病人有肝硬化。肝癌的治療可分為四類：外科治療(腫瘤切除和肝移植)，經(jīng)皮介入治療(乙醇注射、射頻熱剝蝕)，經(jīng)血管介入治療(栓塞、化學藥物灌注、化學藥物栓塞)和藥物治療(包括基因和免疫治療)。有望治愈腫瘤的方法包括腫瘤切除、肝移植和經(jīng)皮介入治療。經(jīng)過選擇的病人接受經(jīng)動脈介入治療可提高部分病人的生存時間。

3、藥物治療和常規(guī)放射治療沒有明顯療效。外科治療方面，不合并肝硬化的肝癌病人接受手術切除是危險性相對比較低，治療效果比較肯定的選擇，遺憾的是大多數(shù)病人合并肝硬化，切除范圍受到限制，切除范圍過大容易導致手術后肝衰竭。肝功能正常、腫瘤單發(fā)、無臨床癥狀的肝癌病人手術效果比較好，五年生存率可以達到70﹪。但是腫瘤成功切除五年后，有70﹪的病人硬化的肝臟可能再發(fā)生癌癥。肝移植應該是治療肝癌比較有效的方法，能一次性切除腫瘤和硬化的肝臟，還能防止腫瘤復發(fā)

4、，但是如果腫瘤體積大或者多發(fā)則治療效果不佳，另外供肝來源不足也極大地限制了該方法的使用，該治療方法的推廣應用還面臨著倫理、社會和法律等諸多問題。經(jīng)皮介入治療僅僅適用于瘤體比較小而且不能手術切除的肝癌病人，可通過乙醇注射、射頻或微波熱療激光熱療、及冷凍等方法進行，使用范圍有限。經(jīng)動脈栓塞或化學栓塞治療適用于既不能手術切除又不能通過經(jīng)皮途徑治療的肝癌病人。有15-50﹪的病人對該治療方法部分有效，與保守治療比較能延長病人生存時間，肝功能差的

5、病人無益處?？傊畟鹘y(tǒng)治療方法治療效果不十分理想，病人預后差。隨著分子生物學的進展人們觀察到一些基因改變與肝癌有關，例如：p53變異、c-myc和cyclin D1過度表達，雜合性缺失(10ss of heterozygosity LOH)伴有腫瘤抑制基因失活，肝癌細胞中1p，4q，6q，8p，13q，16q and 17p位點經(jīng)常發(fā)生，另外幾個生長因子也與肝癌的發(fā)生有關，包括轉化生長因子a和B等。但是肝癌發(fā)生的分子機制尚不十分明了。

6、 近來有越來越多的證據(jù)表明表皮生長因子(EGFR)是有希望的腫瘤治療靶點，許多腫瘤顯示EGFR異常增強或結構性EGFR表達。有報道人肝細胞癌EGFR表達，與腫瘤的侵襲性生長特性有關。尤其是低分化肝細胞癌．EGFR過表達，是預后不良的指標，它與腫瘤早期復發(fā)和肝外轉移正相關。因此EGFR．是治療肝細胞癌新方法的有希望的靶點。 近幾年研究發(fā)現(xiàn)EGF/EGFR系統(tǒng)對肝細胞生長有強刺激作用。表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因erb

7、B-1的表達產(chǎn)物，屬I型跨膜酪氨酸激酶糖蛋白生長因子受體,分子量約為170KD。配體與EGFR結合后，啟動其信號轉導，引起下游一系列的級聯(lián)反應，主要通過兩條途徑將信號傳遞至細胞核，～條是Ras→Raf→MAPK(有絲分裂原活化蛋白激酶)途徑，通過c-jun、c-fos將信號傳導至核內(nèi)激活AP．1；另一條是P13K(磷脂酰肌醇3激酶)→PKC→IKK途徑，使IkBα磷酸化后導致NF-KB移位至核內(nèi)，最終將胞外信號傳導至核內(nèi)，促使細胞增殖、

8、血管形成及抑制調(diào)亡，當EGFR過度表達或表達失調(diào)時會導致腫瘤形成。研究顯示肝細胞癌常有EGFR過度表達或異常表達，抑制EGFR系統(tǒng)能抑制有EGFR表達的人肝癌細胞生長。目前，以EGFR為目標的治療方略集中在細胞外配體結合部、細胞內(nèi)酪氨酸激酶和配體。 臨床前研究和臨床研究顯示多種單克隆抗體阻斷細胞外EGFR與其配體的結合，具有一定抗腫瘤作用。在第一代抗EGFR抗體Cetuximab剛剛經(jīng)過歐洲和美國使用核準幾星期后，第二代抗EGF

9、R抗體已經(jīng)在澳大利亞進入最初的臨床試驗階段。兩篇發(fā)表于生物化學雜志的文章，提到這種新一代的EGFR抗體806，可以在正常細胞和癌細胞上辨別EGFR分子。目前市面上已經(jīng)有一個抗EGFR抗體，更多的抗體正在進行臨床試驗。盡管這些抗EGFR抗體在患者體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤的活性，但是它們離理想還有一段距離，因為它們多數(shù)無法區(qū)別癌細胞和正常細胞的EGFR。這些第一代抗體會造成副作用，因為它們也把正常的組織當作攻擊目標，雖然這些副作用是溫和的，但卻經(jīng)常

10、發(fā)生。更重要的是，第一代抗體的臨床應用和能力均受到限制。806抗體的動物研究顯示，它可以針對過度表達EGFR的癌細胞產(chǎn)生抑制作用。 Erlotinib是一種可口服的EGFR-TK活性抑制物，作用具有可逆性。Erlotinib的作用機制是競爭性抑制ATP與受體TK部位的結合，從而抑制EGFR的自動磷酸化。FDA已經(jīng)批準該藥為處方藥。有研究顯示Erlotinib導致的EGFR-TK抑制能通過誘導凋亡和使細胞周期停止在G1/S轉變期而

11、抑制人肝癌細胞生長。上述研究都是在EGFR形成后，再對其本身或配體與其結合后的下游過程進行干預。其主要不足是不能減少EGFR的生成，抑制作用不完全、不持久。 RNAi是指由內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(double strain ribose nucleic aciddsRNA)介導，并引起細胞內(nèi)同源靶基因表達沉默或抑制的效應，這一現(xiàn)象屬于轉錄后的基因沉默機制。在RNAi反應過程中，雙鏈RNA被核糖核酶-Ⅲ(Dicer酶)切割為2

12、1～23個核苷酸長度的小干擾核糖核酸(small interference ribose nucleicacid siRNA)，siRNA再與含有核酸內(nèi)切酶的核酶復合物結合形成RNA誘導沉默復合體RISC(ribose nucleic acid induced silence complex RISC)，進而識別并和與siRNA具有完全互補序列的同源mRNA結合，將之裂解，引起基因沉默，從而特異高效率地抑制目的基因蛋白的表達。有研究表明

13、，帶有shRNA(小發(fā)夾RNA)表達框架的載體可以取得較高的RNA干擾效應，然而其作為抗肝細胞癌藥物的潛能仍需實驗驗證。本實驗的目的：1.用EGFR shRNA質(zhì)粒載體對HepG2細胞(人肝癌細胞)進行體外RNA干擾實驗，驗證EGFR基因沉默效果。2.構建表達EGFRshRNA重組腺病毒，評價它對HepG2細胞生長抑制的效果。 方法：1.用重組pSIREN-hERa質(zhì)粒轉染HepG2細胞，通過RT-PCR、WesternBlot

14、、MTT及流式細胞儀檢測其RNA干擾后細胞的EGFR蛋白、mRNA表達改變及細胞周期和細胞增殖性能的變化，驗證EGFR基因沉默效果。 2．將質(zhì)粒載體中的U6 shRNA表達框架切下，插入到腺病毒DNA載體中，構建重組腺病毒載體(recombinant pAdeno-hER<'RNAi>DNA vector)，經(jīng)人胚腎293細胞包裝后獲得用于RNA干擾的重組腺病毒(Adeno-hER<'RNAi>virus)。通過Xho I酶切分

15、析及PCR分析，鑒定重組腺病毒是否含有插入的目的序列。用100 pfu/cell的重組腺病毒感染HepG2細胞，分析處理后細胞的生物學特征變化，評價重組腺病毒的RNA干擾效率。 結果：1．DNA序列測定結果證實重組質(zhì)粒載體pSIREN-hERs構建正確，插入序列位置正確。PCR及酶切鑒定結果，重組腺病毒含有目的插入序列。 2．重組質(zhì)粒pSIREN-hERa轉染HepG2細胞后，RT-PCR，Westem．blot，MTT

16、及流式細胞儀檢測結果顯示：處理后細胞的EGFR mRNA、EGFR蛋白表達量下降，細胞增殖活性下降，細胞周期停滯及凋亡增加。 3．重組腺病毒pAdeno-hER<'RNAi> vires感染HepG2細胞后Real Time RT-PCR、Westem-blot及流式細胞儀檢測結果顯示：pAdeno-hER<'RNAi> virus處理后細胞的EGFR mRNA、EGFR蛋白表達量明顯下降，凋亡增加，其中重組腺病毒處理后細胞的E