腺病毒介導(dǎo)的PUMA過表達(dá)對小鼠肝再生的影響.pdf

1、促凋亡蛋白PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)作為重要的p53靶分子，屬于凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族，是BH3-only亞族的重要成員，僅擁有一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，通過和其他家族成員的相互作用，發(fā)揮轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號的功能，在凋亡信號通路中處于中心位置。此外，它在進(jìn)化上極端保守，例如小鼠和人PUMA的基因同源性為91％，蛋白質(zhì)同源性為90％；puma基因通過可變剪接能夠產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中有活

2、性的產(chǎn)物主要是PUMA-α(23kDa)和PUMA-β(18kDa)。 在生理狀態(tài)下PUMA受到嚴(yán)格地調(diào)控，基礎(chǔ)表達(dá)量較低；但在多種應(yīng)激因素(如DNA損傷，缺氧，糖皮質(zhì)激素及血清撤除等)刺激下，可通過p53依賴和非依賴兩條途徑被誘導(dǎo)，產(chǎn)生顯著的促凋亡效應(yīng)。 由于肝再生過程中涉及到多個(gè)Bcl-2家族成員(如Bcl-2，Bcl-XL，Bax等)參與，但它們在肝再生早期的表達(dá)關(guān)系難以解釋此時(shí)細(xì)胞凋亡罕見的現(xiàn)象；此外BH3-on

3、ly亞族分子對肝再生的調(diào)控作用未知，因此我們選擇了和已知的肝再生凋亡通路關(guān)系密切的PUMA作為研究的切入點(diǎn)，運(yùn)用腺病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)技術(shù)，探討它對肝再生早期的影響及其作用機(jī)制。 本課題研究的主要內(nèi)容是：1、肝再生早期PUMA及其相關(guān)基因的表達(dá)變化：2、腺病毒介導(dǎo)基因過表達(dá)模型的建立；3、過表達(dá)PUMA對肝再生的影響。 首先，我們通過Western blotting、Real time PCR和免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PU

4、MA在肝內(nèi)圍繞小葉中央靜脈呈極性分布，其基礎(chǔ)表達(dá)量較低；在肝再生早期(0h～72h)PUMA在mRNA和蛋白水平均發(fā)生顯著下調(diào)，這種依賴轉(zhuǎn)錄的表達(dá)下調(diào)和轉(zhuǎn)錄抑制因子Slug的上調(diào)存在一定的相關(guān)性，而和p53在肝再生早期的上調(diào)無關(guān)；與其密切相關(guān)的Bcl-2家族成員Bcl-XL和Bax在蛋白水平均逐漸上調(diào)，并且Bax的變化與p53相關(guān)，然而凋亡效應(yīng)酶Caspase3卻未見激活。 為了解這些現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們于是采用腺病毒介導(dǎo)的

5、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，通過尾靜脈注射的方法使重組腺病毒Ad-PUMA和腺病毒空載體Ad-GFP感染C57小鼠肝臟，令外源基因在肝臟過表達(dá)，爾后進(jìn)行部分肝臟切除術(shù)，檢測術(shù)后24h再生肝細(xì)胞的增殖和凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用高劑量(4×108ifu)Ad-GFP感染小鼠，可以獲得約30％的肝臟感染效率，并能在注射后3～8天維持外源基因的表達(dá)，對術(shù)后1～5天的再生肝重量無明顯影響；而用極高劑量(1×109ifu)和高劑量(4×108ifu)Ad-PUMA注

6、射小鼠會誘導(dǎo)急性肝衰竭，注射后48h死亡率分別為100％和35.7％，組織學(xué)檢測顯示肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫、壞死，肝門部位嚴(yán)重出血和炎細(xì)胞侵潤。低劑量(2×108ifu)Ad-PUMA預(yù)處理后，術(shù)前未見小鼠急性期死亡，肝臟也無異常表現(xiàn)，但術(shù)后24h死亡率驟升至66.7％，解剖見殘余肝臟腫脹明顯，組織學(xué)檢測Ad-PUMA的肝臟感染效率僅約10％；Western blotting檢測術(shù)后24h PUMA較正常水平僅上調(diào)約1倍；PCNA和TUNE

7、L染色表明再生肝細(xì)胞增殖減少，凋亡增多，并伴有明顯的炎癥改變；Ad-PUMA感染后能使Bcl-XL反應(yīng)延遲并上調(diào)Bax水平。與此對照，Ad-GFP在相同劑量下并不會引起小鼠急性期死亡和明顯的炎癥反應(yīng)，也不顯著升高術(shù)后24h死亡率，同溶劑組(注射等體積PBS)比較亦無明顯差異。 因此我們認(rèn)為腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可以高效地使外源基因在肝臟表達(dá)，并且腺病毒載體本身在當(dāng)前的劑量下不會產(chǎn)生顯著的肝臟毒性，經(jīng)Ad-GFP注射后小鼠的手術(shù)

8、耐受性好，腺病毒載體并不影響再生肝的重量，不會干擾肝再生的總體進(jìn)程。 而PUMA的輕度過表達(dá)即可影響早期肝再生進(jìn)程，引起明顯的肝臟病理改變，說明它的下調(diào)對肝再生具有非常積極的意義，這可能是術(shù)后殘余肝細(xì)胞在再生早期抵御凋亡的機(jī)制之一。其生理意義在于：通過調(diào)節(jié)PUMA的表達(dá)水平來發(fā)揮肝細(xì)胞的自我保護(hù)作用，降低肝細(xì)胞對外界不良刺激的敏感性，提高對凋亡的反應(yīng)閾值，有利于肝細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。其作用機(jī)制可能包括在Slug調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)錄受抑，從而