腺病毒介導的FIt3配體小鼠肝癌治療研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文腺病毒介導的FIt3配體小鼠肝癌治療研究姓名：楊慶申請學位級別：博士專業(yè)：肝膽外科學指導教師：楊廣順2001.5.1中文摘要FL是新發(fā)現的早期造血生長因子，具有刺激機體造血和增強機體免疫功能的雙重作用。為了觀察肝癌局部FL基因轉移的抗腫瘤效果，本實驗選擇重組腺病毒作為攜帶mFL的載體。首先，應用高效細菌內同源重組系統，構建了攜帶mFL的重組腺病毒載體。PCR擴增含有mFL的質粒，構建重組穿梭質粒，線性化后與腺病毒

2、骨架質粒pAdEasy。1共轉化BJ5183大腸桿菌，并在其中發(fā)生同源重組，利用抗性的變化篩選重組腺病毒質粒。Lipofectamine轉染293細胞，重組腺病毒AdmFL在其中復制和擴增，利用重組整合入腺病毒骨架中的綠色熒光蛋白(GFP)可以直接地觀察轉染與感染的效率。反復“感染收集凍融”，將108感染后的293細胞裂解上清CsCl梯度超速離心純化，測定AdmFL滴度為84x10IIefu／ml，空載體對照病毒為62x1011efu／

3、ml。本實驗構建的腺病毒為下一步動物體內實驗奠定了基礎。一(體外分別以MOI為10、100、500的AdmFL感染小鼠肝癌細胞Hepal6，兩天后熒光顯微鏡下根據GFP的表達計算感染率分別是5％、60％和95％。體外以MOI為100的AdmFL對體外感染后的Hepal一6細胞無直接的生長抑制作用。在感染后的Hepal6細胞內RT—PCR擴增到了mFL的mRNA，應用ELISA檢測培養(yǎng)上清中mFL蛋白的濃度為80573ng／ml，證明腺病

4、毒能有效地感染靶細胞，并介導所攜帶mFL的高效表達。腫瘤內注射1109efuAdmFL對C57BL／6小鼠肝癌有明顯的治療作用。建立小鼠的異位肝癌模型，分別腫瘤內單次注射l109efuAdmFL、空病毒載體對照和PBS對照，觀察平均腫瘤大小和小鼠生存率。與對照相比，AdmFL能明顯地抑制腫瘤生長，治療后37天89％(8／9)的小鼠腫瘤完全消退，并顯著延長荷瘤小鼠的生存期。同時，AdmFL還能激發(fā)特異性免疫保護反應，保護了100％(6／6