腺病毒介導(dǎo)的URG11RNAi抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)制研究.pdf

1、URG11是利用抑制消減雜交及全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增技術(shù)（RACE-PCR）克隆的一個(gè)可以被乙肝病毒X蛋白上調(diào)的新基因，編碼70KD蛋白質(zhì)。該蛋白含有2個(gè)VWFC結(jié)構(gòu)域及一個(gè)C型凝集素結(jié)構(gòu)域。VWFC結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞黏附、遷移、淋巴細(xì)胞的歸巢及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，而C型凝集素結(jié)構(gòu)域參與細(xì)胞的增殖、分化。 前期研究表明，URG11在肝癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤惡性程度相關(guān)。 URG11還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化，增強(qiáng)軟瓊脂克隆形成能

2、力及癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力，及通過(guò)上調(diào)β-橋連蛋白（β-catenin）的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體外移動(dòng)、黏附。另發(fā)現(xiàn)，它可增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。 因此，URG11是一個(gè)和腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)并具有重要功能的新基因，但是否可作為肝癌治療，尤其腺病毒介導(dǎo)的基因治療新靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步闡明。 【目的】 利用URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒進(jìn)行肝癌基因治療實(shí)驗(yàn)，闡明URG11對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

3、，并初步探討相應(yīng)的分子機(jī)制。 【方法】 1、構(gòu)建URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒載體；利用包裝的腺病毒感染URG11高表達(dá)的人肝癌細(xì)胞系HHCC 及URG11 低表達(dá)的QZG 細(xì)胞系，下調(diào)或上調(diào)其中URG11 蛋白表達(dá)水平，利用Western blot 方法進(jìn)行檢測(cè)； 2、采用MTT 法繪制感染細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期分布情況； 3、進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)和基因治療

4、實(shí)驗(yàn)，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因功能； 4、進(jìn)行雙向凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)，篩選URG11 促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的上下游分子。 【結(jié)果】 1、URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒包裝及鑒定我們應(yīng)用腺病毒載體購(gòu)建試劑盒，成功構(gòu)建并包裝了URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒（Ad-CMV、Ad-pi0 為陰性對(duì)照），應(yīng)用URG11-SiRNA 腺病毒感染肝癌細(xì)胞HHCC，經(jīng)Western Blot 實(shí)驗(yàn)

5、證實(shí)，可以有效降低URG11 蛋白的表達(dá)水平，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2、腺病毒介導(dǎo)的URG11siRNA 抑制肝癌細(xì)胞體外增殖首先應(yīng)用Western Blot 檢測(cè)三種肝癌細(xì)胞系HHCC、SMMC7721、HepG2及人永生化肝細(xì)胞QZG 中URG11 蛋白表達(dá)情況，證實(shí)該蛋白在四種細(xì)胞均有不同程度表達(dá)，其中HHCC 表達(dá)水平最高，而QZG 表達(dá)水平最低；URG11-SiRNA腺病毒感染肝癌細(xì)胞HHCC 后進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

6、,URG11 蛋白表達(dá)水平下調(diào)明顯抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05)；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染后細(xì)胞凋亡和周期分布的變化，發(fā)現(xiàn)下調(diào)該基因能夠減少細(xì)胞G1-S 期阻滯并促進(jìn)凋亡(P<0.05)；而URG11 腺病毒感染QZG 細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，造成細(xì)胞G1-S期阻滯并抑制凋亡(P<0.05)。 3、腺病毒介導(dǎo)的URG11siRNA 抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，用攜帶URG11-SiRNA 的腺病毒與肝癌細(xì)胞HHCC 細(xì)胞

7、混合后注射裸鼠，可以通過(guò)下調(diào)URG11 表達(dá)在一定程度上抑制HHCC 細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力；URG11-SiRNA 腺病毒直接注入瘤體，可以明顯減小腫瘤體積（P<0.05）。 4、URG11 上下游效應(yīng)分子的篩選在相似條件下重復(fù)進(jìn)行雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，利用Melanie3 2-D 分析軟件分析，從蛋白雙向電泳圖譜中選取穩(wěn)定差異表達(dá)的、大小集中在20kd 至100kd之間的19 個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行切割，經(jīng)過(guò)脫銀、蛋白酶消化后，進(jìn)行飛行