腺病毒介導(dǎo)重組人源化ING4基因抑制非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞生長機(jī)制研究.pdf

1、目的：重組構(gòu)建人源化ING4腺病毒表達(dá)載體，并探究其對非小細(xì)胞肺癌NCI—H460細(xì)胞株體內(nèi)外生長抑制作用及其相關(guān)分子機(jī)制。 方法：運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)，在已成功克隆mING4（鼠ING4）的基礎(chǔ)上，根據(jù)hING4（人ING4）氨基酸序列，進(jìn)行重組構(gòu)建。設(shè)計(jì)兩對突變引物P1、P2和P3、P4及全長ING4上下游引物P5、P6，通過四輪PCR，將mING4基因序列進(jìn)行人源化改造，獲得了編碼hING4氨基酸的基因序列（簡稱ING4）。將

2、獲得酶切目的基因片段，連接到轉(zhuǎn)移載體pAdTrack—CMV上，形成重組轉(zhuǎn)移載體pAdTrack—CMV—ING4。重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)PmeⅠ酶切后與pAdEasy—1腺病毒載體在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到重組腺病毒載體pAdeasy—1—pAdTrack—CMV—ING4，經(jīng)PacⅠ酶切后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI—293A包裝細(xì)胞，獲得重組腺病毒Ad—ING4。通過類似的方法獲得了重組空載體病毒Ad—null。將獲得同源重組Ad—ING

3、4病毒感染非小細(xì)胞肺癌NCI—H460細(xì)胞（p53野生型），運(yùn)用RT—PCR及熒光顯微鏡檢測ING4基因在H460細(xì)胞中表達(dá)及對H460細(xì)胞毒作用（CPE）；運(yùn)用MTT法、細(xì)胞集落形成試驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測Ad—ING4對腫瘤細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用；運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡及透射掃描電鏡檢測H460細(xì)胞經(jīng)ING4基因作用后形態(tài)學(xué)改變；運(yùn)用RT—PCR、Western—blotting檢測分析Ad—ING4誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能分子機(jī)制；運(yùn)用

4、RT—PCR和ELISA方法檢測ING4基因?qū)δ[瘤主要血管生成相關(guān)基因VEGF的作用；在nu/nu裸鼠皮下建立NCI—H460肺癌荷瘤鼠模型，觀察Ad—ING4基因?qū)δ[瘤生長抑制作用及對血管生成影響。 結(jié)果：基因序列檢測和RT—PCR結(jié)果證實(shí)獲得重組人源化ING4基因，并成功構(gòu)建重組人源化ING4腺病毒表達(dá)載體。RT—PCR和熒光顯微鏡檢測證實(shí)ING4基因可以在H460細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)并對H460細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用（CPE）；MT

5、T檢測和細(xì)胞集落形成試驗(yàn)結(jié)果表明較對照組（Ad—null組，PBS組）相比，ING4基因可以明顯抑制基因治療組腫瘤細(xì)胞生長；流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)Ad—ING4可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；激光共聚焦顯微鏡和透射掃描電鏡檢測顯示H460細(xì)胞經(jīng)ING4基因作用后可發(fā)生細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，并出現(xiàn)凋亡小體；RT—PCR、Western—blotting檢測結(jié)果提示Ad—NG4基因以p53依賴方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上調(diào)p21和Bax基因表達(dá)，下調(diào)Bcl—2和Sur

6、vivin基因表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；RT—PCR和ELISA檢測提示ING4基因可以抑制腫瘤主要血管生成相關(guān)基因VEGF表達(dá)；體內(nèi)試驗(yàn)表明Ad—ING4基因可以抑制腫瘤生長并抑制腫瘤體內(nèi)血管生成。 結(jié)論：運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)對mING4進(jìn)行了人源化改造，并成功重組構(gòu)建了人源化ING4腺病毒表達(dá)載體；經(jīng)RT—PCR和熒光顯微鏡檢測證實(shí)腺病毒Ad—ING4可以在非小細(xì)胞肺癌NCI—H460細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)；腺病毒Ad—ING4在非小細(xì)

7、胞肺癌NCI—H460細(xì)胞株中表達(dá)可致肺癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），并主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤細(xì)胞增殖；腺病毒Ad—ING4誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌NCI—H460細(xì)胞凋亡的主要分子機(jī)制是以p53依賴方式上調(diào)促凋亡因子Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl—2、Survivin表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；腺病毒Ad—ING4同時(shí)通過促進(jìn)p53反應(yīng)基因p21表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，并改變Bax/Bcl—2比例，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；腺病毒Ad—I