重組人FGF18對(duì)非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖、遷移作用及其機(jī)制研究.pdf

1、前言：近年來(lái)，盡管在癌癥的診斷和治療方面的技術(shù)有所改進(jìn)，但是肺癌仍然是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，且長(zhǎng)期存活率較低。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85％，由于其高侵襲性、易遷移、復(fù)發(fā)率高，大多數(shù)NSCLC對(duì)化學(xué)治療和放射治療不敏感。因此進(jìn)一步了解和探索NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的分子機(jī)制顯得尤為重要。很多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都已驗(yàn)證了FGFs家族成員在肺癌發(fā)生過(guò)程中起到關(guān)

2、鍵作用，且越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)GF/FGFR信號(hào)通路可激活多條下游信號(hào)通路如絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）,磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase,PI3K）,蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)等參與肺癌的多項(xiàng)進(jìn)程，如促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等。有報(bào)道稱成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18(Fibroblast growth

3、 factor18, FGF18)在直腸癌和乳腺癌中表達(dá)升高，且FGF18蛋白以及基因表達(dá)的增加與腫瘤進(jìn)程以及患者總生存較差相關(guān)。不過(guò)目前關(guān)于 FGF18在肺癌中的作用仍未有報(bào)道。
　　目的：1.觀察FGF18對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的增殖促進(jìn)作用和細(xì)胞周期變化。
　　2.研究FGF18對(duì)H460細(xì)胞的遷移促進(jìn)作用以及遷移相關(guān)蛋白MMP26表達(dá)水平的影響，從而揭示FGF18促進(jìn)H460細(xì)胞遷移的部分機(jī)制。
　　3.

4、研究ERK、p38信號(hào)分子在FGF18促進(jìn)H460細(xì)胞增殖、遷移過(guò)程中的作用。4.探討FGF18-siRNA對(duì)H460細(xì)胞的增殖、遷移作用，以確定FGF18作為肺癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。
　　方法：1.采用MTT法觀察FGF18分別以不同濃度（0、5、10、50、100、200 ng/ml）、不同時(shí)間（0、24、48、72 h）作用后在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的增殖作用；采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度（0、5、10、50 ng/ml）

5、FGF18對(duì)H460細(xì)胞周期的影響。
　　2.應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察FGF18對(duì)H460細(xì)胞的遷移作用；應(yīng)用Western Blot和RT-qPCR檢測(cè)FGF18對(duì)遷移相關(guān)蛋白MMP26基因以及蛋白水平的影響。
　　3.FGF18作用于H460細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白ERK、p-ERK、p38、p-p38表達(dá)變化；特異性ERK抑制劑FR180204、p38抑制劑SB203580預(yù)處理FGF18刺激的H460

6、細(xì)胞：MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的變化，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白MMP26表達(dá)變化。
　　4.將FGF18-siRNA轉(zhuǎn)染入H460細(xì)胞，應(yīng)用Western Blot和RT-qPCR檢測(cè)FGF18抑制效率；檢測(cè)H460細(xì)胞內(nèi)增殖、遷移及蛋白的變化。
　　結(jié)果：1.MTT法檢測(cè)得出FGF18促進(jìn)了H46O細(xì)胞的增殖，并表現(xiàn)出時(shí)間梯度以及濃度梯度的依賴性，其中低濃度組（5、10、50 ng

7、/ml）與高濃度組（100、200 ng/ml）相比，前者作用濃度更佳。故流式細(xì)胞術(shù)分析了低濃度的FGF18對(duì)H460的作用。結(jié)果顯示FGF18增加了H460細(xì)胞周期中的G0/G1期比例，降低了S期跟G2/ M期的比例，表明可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期從而促進(jìn)了細(xì)胞增殖。2.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示FGF18（0、5、10、50 ng/ml）促進(jìn)了H460細(xì)胞的遷移，MMP26在 mRNA水平以及蛋白水平表達(dá)都有明顯提高，可能是通過(guò)增加遷移相關(guān)蛋白MMP

8、26的表達(dá)而影響了遷移作用。
　　3.與對(duì)照組相比，低濃度FGF18作用組的p-ERK/ERK和p-p38/p38同時(shí)上調(diào),且隨著濃度的增加兩者的表達(dá)水平逐漸升高；分別使用ERK抑制劑(FR180204)和p38抑制劑SB203580后，均抑制了FGF18對(duì)H460細(xì)胞的促增殖、促遷移作用，但對(duì)MMP26蛋白的表達(dá)并無(wú)明顯作用。
　　4.轉(zhuǎn)染siRNA-FGF18后有效地抑制了FGF18的表達(dá)，mRNA以及蛋白水平驗(yàn)證FGF

9、18表達(dá)的抑制率分別為20%和48.7%；與對(duì)照組相比，si-FGF18組細(xì)胞增殖、遷移能力均受抑制，除細(xì)胞周期無(wú)明顯變化外，MMP26、p-ERK和 p-p38表達(dá)水平均顯著降低。
　　結(jié)論：1.FGF18可通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)促進(jìn)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的增殖作用。
　　2.FGF18可通過(guò)增加MMP26的表達(dá)來(lái)促進(jìn)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的遷移作用。
　　3.FGF18激活了人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中ERK、p38信