WWTR1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　近年來,肺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均明顯上升,已對(duì)人類健康形成極大威脅。探討肺癌發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制,據(jù)此發(fā)現(xiàn)有效的治療肺癌的靶向藥物靶點(diǎn)以及對(duì)肺癌靶向藥物療效的評(píng)估已成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　Hippo通路在細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,已證實(shí)其在胚胎發(fā)育,組織器官形成以及自身穩(wěn)態(tài)保持等方面都具有重要作用,最近研究發(fā)現(xiàn)Hippo通路功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。WWTR1(WW domain c

2、ontaining transcription regulator1, WW域轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1)作為Hippo通路下游的效應(yīng)分子能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用,發(fā)揮生物學(xué)功能。已有研究顯示W(wǎng)WTR1是一個(gè)癌基因,并可促進(jìn)乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展,但WWTR1調(diào)節(jié)肺癌增殖和凋亡分子機(jī)制仍不清楚。本論文旨在明確WWTR1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系,并進(jìn)一步探討WWTR1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響及其可能的調(diào)

3、節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　(1)選取105例非小細(xì)胞肺癌和10例正常肺組織標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了WWTR1的表達(dá)情況。
　　(2)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析WWTR1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理因素的關(guān)系。
　　(3)應(yīng)用Western blot和Real-time PCR檢測(cè)了正常支氣管上皮細(xì)胞HBE和一系列肺癌細(xì)胞系(LK2、H1299、H460、H446、A549)中的WWTR1的蛋白和mRNA表達(dá)情況。

4、
　　(4)選取高表達(dá)WWTR1的細(xì)胞系A(chǔ)549和低表達(dá)WWTR1的HBE細(xì)胞,通過轉(zhuǎn)染外源基因或siRNA干擾進(jìn)行基因調(diào)控:在A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WTR1 siRNA,下調(diào)WWTR1表達(dá);在HBE細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WTR1質(zhì)粒,上調(diào)WWTR1表達(dá)。
　　(5)采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染W(wǎng)WTR1的HBE細(xì)胞和干擾了WWTR1的A549細(xì)胞的增殖能力的變化。
　　(6)用紫杉醇處理基因調(diào)控后的HBE和A549細(xì)胞,

5、應(yīng)用Annexin V/PI流式雙染技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力的變化。
　　(7)采用流式細(xì)胞周期術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染W(wǎng)WTR1的HBE細(xì)胞和干擾WWTR1的A549細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。
　　(8)使用Western blot和Real-time PCR篩選WWTR1調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　(1)免疫組化染色結(jié)果顯示W(wǎng)WTR1主要在肺癌組織的細(xì)胞核或細(xì)胞漿中表達(dá),也有部分肺癌組織中存在WWTR1的

6、核漿共表達(dá)。在檢測(cè)的105例非小細(xì)胞肺癌組織中,有44例呈WWTR1陽性表達(dá),其陽性表達(dá)率為41.90％(44/105)。
　　(2)分析WWTR1在肺癌組織中陽性表達(dá)與各種臨床病理因素的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,WWTR1陽性表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)(I期vsII+III期;25.71%vs50.00%;p=0.0174);WWTR1陽性表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)(T1+T2 vs T3;36.59%vs60.87%;p=0.0370);

7、另外WWTR1陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(N0 vs N1+N2;32.65% vs50.00%;p=0.0723)。WWTR1的陽性表達(dá)與肺癌患者的年齡(p=0.7060),性別(p=0.1510),組織類型(p=0.4608),分化程度(p=0.9166)均無顯著相關(guān)。
　　(3)應(yīng)用Western blot和Real-time PCR檢測(cè)了支氣管上皮細(xì)胞HBE和一系列肺癌細(xì)胞系(LK2、H1299、H460、H446和A5

8、49)中WWTR1的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WWTR1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于正常的支氣管上皮細(xì)胞系HBE。尤其是在A549細(xì)胞系中呈明顯的高表達(dá)。
　　(4)通過MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WWTR1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。在A549細(xì)胞中通過WWTR1特異性siRNA下調(diào)WWTR1后,細(xì)胞增殖水平明顯下降;而在過表達(dá)WWTR1的HBE細(xì)胞系中,細(xì)胞增殖能力顯著增加。
　　(5)采用Annexin V/PI流式雙染細(xì)胞術(shù),觀察W

9、WTR1對(duì)經(jīng)過紫杉醇(10nmol/L,24hours)處理的肺癌細(xì)胞的凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在敲除WWTR1后,A549肺癌細(xì)胞的早期凋亡水平和晚期凋亡水平明顯升高,然而在WWTR1過表達(dá)的HBE細(xì)胞系中,細(xì)胞的凋亡水平明顯被抑制。
　　(6)流式細(xì)胞周期檢測(cè)分析顯示,在 WWTR1表達(dá)下調(diào)后,G0/G1期細(xì)胞比例升高而S期細(xì)胞比例降低;相反,在WWTR1表達(dá)上調(diào)后,G0/G1期細(xì)胞比例降低而S期細(xì)胞比例升高。
　　(7)運(yùn)

10、用 Real-time PCR篩查潛在的與增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá),包括CyclinA,CyclinD1,CyclinE,CTGF,c-Myc, Bcl-2, Bcl-xl, XIAP和 Bax。結(jié)果顯示,敲除WWTR1降低Cyclin A和CTGF的mRNA和蛋白表達(dá);而過表達(dá)WWTR1增加Cyclin A和CTGF的mRNA和蛋白表達(dá)。提示W(wǎng)WTR1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)依賴或部分依賴于CyclinA和 CTGF。另外,過表達(dá)W

11、WTR1可減少Caspase3剪切;而干擾WWTR1可促進(jìn)Caspase3剪切。
　　結(jié)論:
　　(1)WWTR1在非小細(xì)胞肺癌組織中存在過表達(dá),并且WWTR1陽性表達(dá)與肺癌TNM分期、腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。
　　(2)WWTR1在肺癌細(xì)胞系中存在過表達(dá);WWTR1促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖。
　　(3)WWTR1抑制紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的凋亡。
　　(4)WWTR1可促進(jìn)肺癌細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變。