CCL21-CCR7調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖和凋亡機(jī)制研究.pdf

1、前言:趨化因子是一類由不同類型細(xì)胞分泌的對(duì)免疫細(xì)胞具有趨化作用的細(xì)胞因子。CCL21是趨化因子成員之一,主要在淋巴結(jié)和脾臟高表達(dá),此外大多數(shù)器官的淋巴管內(nèi)皮也有表達(dá)。CCR7是CCL21的受體,在幼稚T細(xì)胞、B細(xì)胞及樹突細(xì)胞表面表達(dá)。生理?xiàng)l件下,CCL21/CCR7在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞歸巢及免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CCR7,如乳腺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌等,CCR7的表達(dá)與這些腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

2、密切相關(guān)。Noelia等報(bào)道了,在成熟樹突細(xì)胞中趨化因子CCL19、CCL21能促進(jìn)PI3k/Akt和ERK的活化,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制凋亡。然而,CC21/CCR7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響卻不清楚。本研究的目的是研究CCL21/CCR7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):A549和H460細(xì)胞使用含10％胎牛血清(Hyclone,美國(guó))的DMEM-F12及RPM

3、I1640培養(yǎng)液(Sigma,美國(guó)),于37℃、5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。
　　 2、siRNA干擾:A549和H460細(xì)胞分別接種到6孔板中,根據(jù)Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書,細(xì)胞貼壁后用無血清培養(yǎng)2-3h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,6-8h后換為含10％血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要培養(yǎng)24h。
　　 3、CCK-8分析:處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H460細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液,接種

4、于96孔培養(yǎng)板中,每孔接種1×103個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)0h、24h、48h或72h后檢測(cè)。在測(cè)定前每孔加入10μLCCK-8溶液后孵育4h。在450nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。
　　 4、流式細(xì)胞儀:應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549和H460細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況。
　　 5、RT-PCR和real-time PCR:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用TRIZOL(Invitrogen,美國(guó))提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增,1.5％瓊脂糖凝膠

5、電泳,用Image J軟件進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。Real-time PCR,根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒的說明書操作。所有反應(yīng)均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔,以β-actin為內(nèi)參照。
　　 6、Western blot:收集細(xì)胞,提取總蛋白,50微克總蛋白經(jīng)10％和12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。結(jié)果經(jīng)Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析。
　　 7、免疫共沉淀(CoIP):按

6、照CoIP試劑盒說明書操作,檢測(cè)蛋白與蛋白的相互作用情況。
　　 8、統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;用單因素方差分析評(píng)價(jià)各種處理組間的不同,隨后的亞組分析用LSD檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn);趨勢(shì)分析采用多項(xiàng)式對(duì)比;數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、CCL21/CCR7通過ERK途徑促進(jìn)G2/M期進(jìn)展,增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌A549

7、和H460細(xì)胞增殖。
　　 (1)CCL21/CCR7促進(jìn)了A549和H460細(xì)胞的增殖:CCK-8分析顯示,當(dāng)A549和H460細(xì)胞暴露到外源性CCL21后,與對(duì)照組相比,其增殖能力明顯增強(qiáng),隨著暴露時(shí)間的增加表現(xiàn)為一種線性趨勢(shì),而CCR7被CCR7 siRNA后,CCL21的這些影響消失。
　　 (2)CCL21/CCR7改變了A549和H460細(xì)胞G2/M期的分布:流式細(xì)胞儀分析顯示,外源性CCL21作用于A549

8、和H460細(xì)胞24h后,其G2/M期的分布發(fā)生明顯改變,而G0/G1期和S期沒有明顯變化;CCR7被CCR7siRNA后,CCL21的這些影響消失。
　　 (3)CCL21/CCR7上調(diào)了A549和H460細(xì)胞cyclin A、cyclin B1和CDK1的表達(dá):real-time PCR和western-blot分析證實(shí),CCL21/CCR7顯著上調(diào)TcyclinA、cyclin B1和CDK1的表達(dá)(與G2/M期進(jìn)展有關(guān)),

9、而沒有明顯影響cyclin D1和cyclin E(分別與G1期和S期進(jìn)展有關(guān))的表達(dá)。
　　 (4)CCL21/CCR7通過ERK途徑調(diào)控A549和H460細(xì)胞增殖:在A549和H460細(xì)胞中,檢測(cè)了CCL21/CCR7對(duì)PI3k/Akt和MAPK途徑的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7可激活ERK途徑,而對(duì)Akt、p38和JNK沒有明顯的影響。細(xì)胞暴露到PD98059(一種MEK的特異性抑制劑,其抑制后可破壞下游ERK的激活

10、)后,再用外源性CCL21刺激細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7的促增殖等效應(yīng)消失。免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)CCL21/CCR7是通過ERK途徑促進(jìn)G2/M期蛋白表達(dá),調(diào)控A549和H460細(xì)胞增殖。
　　 2、CCL21/CCR7通過ERK途徑調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax和Caspase-3表達(dá),抑制非小細(xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞凋亡。
　　 (1)CCL21/CCR7抑制A549和H460細(xì)胞凋亡:外源性CCL21作用于A54

11、9和H460細(xì)胞24h后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7顯著抑制了細(xì)胞凋亡。
　　 (2)CCL21/CCR7通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2及下調(diào)促凋亡因子Bax和Caspase-3基因的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡,與p53途徑?jīng)]有明顯關(guān)系:應(yīng)用real-time PCR和westem blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax,Caspase-3和p53的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7可明顯上調(diào)Bcl

12、-2的表達(dá)及下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá),對(duì)p53表達(dá)沒有明顯影響。
　　 (3)CCL21/CCR7通過激活ERK途徑抑制A549和H460細(xì)胞凋亡:細(xì)胞暴露到PD98059(一種MEK的特異性抑制劑,其抑制后可破壞下游ERK的激活)后,再用外源性CCL21刺激細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7的抗凋亡效應(yīng)消失。免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)CCL21/CCR7是通過ERK途徑上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax和Caspase-3基因的