MDA-7-IL-24選擇性促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和增殖阻滯及其機(jī)制研究.pdf

1、全文分為四部分： 第一部分:攜帶MI)A-7/IL-24基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定 目的:構(gòu)建攜帶人MDA-7/IL-24基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，觀察其在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)，為肝癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法:將人MDA-711L-24 cDNA定向克隆于腺病毒穿梭質(zhì)粒pSGCMV,獲得重組質(zhì)粒pSGCMV-MDA-7,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通

2、過細(xì)胞內(nèi)同源重組，生成攜帶MDA-7/IL-24基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad.mda-7。并用其感染肝癌細(xì)胞株HcpG2, SMMC7721, Hep38以及正常的肝細(xì)胞LQ2, RT PCR方法驗證MDA-7/IL-24的表達(dá)，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA IIL-24蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:通過DNA測序和PT PCR提示攜帶MDA-7/IL-24的復(fù)制缺陷型腺病毒構(gòu)建成功，PT PCR和ELISA方法提示該載體能介

3、導(dǎo)外源基因MDA-ML-24在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中高效表達(dá)。 結(jié)論:成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad.mda-7，該載體能介導(dǎo)MDA-7/IL-24基因在人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中高效表達(dá)。 第二部分Ad.mda-7選擇性殺傷肝癌的體外研究 目的：利用構(gòu)建的攜帶人MDA-7/IL-24基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.mda-7作為載體，感染肝癌細(xì)胞HepG2A SMMC772I, Hep3B< MHCC97L和

4、M6和正常的肝細(xì)胞L02,觀察該基因?qū)Ω伟┑倪x擇性殺傷作用，為肝癌的基毋治療提供理論基礎(chǔ)。 方法：將攜帶人MDA-71IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC772I、Hep3B、MHCC97L和m6.通過RT PCR方法觀察MDA-711L-24基因的表達(dá)，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA-7/[L-24蛋白的濃度，四甲基偶氮哩藍(lán)染色法(MTT )及Hoechst染色觀

5、察MDA-7/IL-24對肝癌細(xì)胞的生長抑制和殺傷作用，Antexin- V和PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果：RT-PCR提示復(fù)制缺陷型腺病毒能介導(dǎo)外源基因MDA-7/IL-24在肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L、M6和正常細(xì)胞L02中高效表達(dá)。ELISA方法檢測提示細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA-7/IL-24蛋白的表達(dá)。MTT實驗結(jié)果表明，MDA-7/IL-2

6、4能明顯抑制各種肝癌細(xì)胞的生長，Hoechst染色提示MDA-7/IL-24促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞儀提示MDA-7能選擇性殺傷肝癌細(xì)胞而對正常的肝細(xì)胞沒有影響，細(xì)胞周期分析提示MDA-7/IL-24阻滯肝癌細(xì)胞在G2/M期，同時對正常的肝細(xì)胞沒有促凋亡作用和增殖阻滯作用。 結(jié)論：復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad.mda-7能介導(dǎo)MDA-7/IL-24基因在人肝癌細(xì)胞中高效表達(dá)，選擇性的殺傷肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC7721、

7、Hep3B、MHCC97L和M6，促進(jìn)細(xì)胞增殖阻滯及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而與腫瘤細(xì)胞的P53基因的狀態(tài)無關(guān)，同時對正常的肝細(xì)胞L02沒有任何毒性作用。 第三部分Ad.mda-7選擇性殺傷肝癌細(xì)胞的機(jī)理探討 目的：探索攜帶MDA-7/IL-24基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.mda-7選擇性殺傷肝癌細(xì)胞的機(jī)理，為肝癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法：將攜帶人MDA-7/IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝細(xì)胞L

8、02和肝癌細(xì)胞HepG2。通過RT-PCR方法觀察MDA-7/IL-24基因的表達(dá)，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA-7/IL-24蛋白的濃度，Westernblot檢測細(xì)胞內(nèi)MDA-7/IL-24的表達(dá)，Hoechst染色觀察MDA-7/IL-24對肝癌細(xì)胞的生長抑制和殺傷作用，Annexin-V和PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡，利用線粒體分離試劑分離感染后0h、6h、12h和24h時段正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞HepG2

9、的線粒體和胞漿蛋白，通過westernblot方法檢查胞漿和線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族和caspase9，線粒體釋放的促凋亡蛋白CytochromeC和Smac/Diablo的變化。 結(jié)果：RT-PCR提示復(fù)制缺陷型腺病毒能介導(dǎo)外源基因MDA-7/IL-24在肝癌細(xì)胞株HepG2和正常細(xì)胞L02中高效表達(dá)。ELISA方法檢測提示細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA-7/IL-24蛋白的表達(dá)，蛋白電泳提示MDA-7蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而且隨

10、著時間的延長表達(dá)增強(qiáng)；Hoechst染色提示MDA-7/IL-24促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞儀提示MDA-7能選擇性殺傷肝癌細(xì)胞而對正常的肝細(xì)胞沒有影響，通過RT-PCR和亞細(xì)胞蛋白的分析發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)抑制凋亡的物質(zhì)Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)在HepG2細(xì)胞中明顯下降，而在L02中沒有表達(dá)的下降，同時促凋亡蛋白Bax和在肝癌細(xì)胞中明顯增強(qiáng)，Bak的表達(dá)沒有明顯的變化。同時促進(jìn)細(xì)胞線粒體釋放細(xì)胞色素C和Smac/Diablo，促進(jìn)Casp

11、ase9的表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。 結(jié)論：復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad.mda-7能介導(dǎo)MDA-7/IL-24基因在人肝癌細(xì)胞中高效表達(dá)，選擇性的殺傷肝癌細(xì)胞HepG2，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制與線粒體促凋亡物質(zhì)的釋放有關(guān)，同時對正常的肝細(xì)胞L02沒有任何毒性作用。 第四部分：重組腺病毒介導(dǎo)的MDA-7/IL-24和阿霉素聯(lián)合治療肝癌的動物實驗研究 目的：將重組腺病毒介導(dǎo)的mda-7/IL-24(mela

12、nomadifferentiation-associatedgene-7)和/或阿霉素(adriamycin,ADM)聯(lián)合治療裸鼠肝癌，探索基因治療和化療相結(jié)合治療腫瘤的新方法。 方法：構(gòu)建攜帶人mda-7/IL-24的重組腺病毒載體(Ad.mda-7)，單獨用其或ADM以及兩者聯(lián)用對實驗性肝癌裸鼠進(jìn)行治療，用RT-PCR和westernblot檢測腫瘤組織中mda-7的表達(dá)，用ELISA方法檢測裸鼠血清內(nèi)MDA-7/IL-24

13、蛋白的濃度變化；并觀察抗腫瘤效果。 結(jié)果：(1)RT-PCR、westernblot和ELISA方法可檢測到Ad.mda-7+ADM組和Ad.mda-7組中mda-7表達(dá)明顯增加。(2)Ad.mda-7+ADM組裸鼠肝癌生長抑制率最大值為70.4％，明顯高于ADM組和Ad.mda-7組的35.9％和46.3％(P＜0.01)；(3)Ad.mda-7+ADM組裸鼠早期死亡率為0，明顯低于ADM組的40％(P＜0.01)；Ad.md