DHA對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡和侵襲力的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、【目的】(1)檢測(cè)不同濃度二十二碳六烯酸(DHA)對(duì)人肝癌細(xì)胞株Bel-7402細(xì)胞增殖的影響。(2)研究不同濃度DHA對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響并進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)凋亡的可能作用機(jī)制。(3)分析不同濃度DHA對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲力的影響,并檢測(cè)其作用肝癌細(xì)胞48h后基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的變化,為肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。
　　【方法】(1)通過(guò)甲基噻唑基四唑比色法(MTT)、臺(tái)酚藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度DHA

2、對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖的影響。(2)運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(FCM)檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡的情況,并通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)方法檢測(cè)不同濃度DHA作用細(xì)胞后Bim基因、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響;再用半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3表達(dá)相對(duì)值的變化。(3)通過(guò)細(xì)胞劃痕及侵襲小室(Transwell)方法檢測(cè)DHA

3、對(duì)Bel-7402肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲力的影響;再運(yùn)用細(xì)胞免疫組化染色方法檢測(cè)MMP-9表達(dá)的影響。
　　【結(jié)果】(1)與對(duì)照組(0μmol/LDHA)比較,不同濃度DHA對(duì)Bel-7402肝癌細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用,且呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆?P<0.05)。(2)在作用Bel-7402細(xì)胞48h后,不同濃度DHA(25,50,100,200μmol/L)處理組細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡率分別為10.28±2.28％,19.49±2.21

4、%,25.20±5.53%和35.01±6.01%,與對(duì)照組(0.02±0.01%)相比,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)檢測(cè)線粒體凋亡通路中與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的各蛋白表達(dá)變化,與對(duì)照組比較,各個(gè)DHA處理組促凋亡基因Bim基因mRNA表達(dá)顯著升高,并與DHA濃度呈正比,其相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低,而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著升高;凋亡蛋白caspase-3的相對(duì)活性顯著增加,

5、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并呈劑量依賴性。(3)在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,DHA(50、100、200μmol/L)處理組透膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)態(tài)觀察0、12、24h,對(duì)照組細(xì)胞劃痕間距明顯縮短,24h后劃痕基本愈合,DHA(50、100、200μmol/L)處理組隨著DHA濃度的增大,細(xì)胞劃痕間距縮短的趨勢(shì)越小,各時(shí)段與對(duì)照組間比較差異顯著。其中,DHA(25μmo

6、l/L)處理組與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度DHA作用48h后,細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示,細(xì)胞MMP-9的表達(dá)隨DHA濃度的增加而逐漸減少,其影響呈劑量相關(guān)性。
　　【結(jié)論】(1)DHA可抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡,且呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆浴?2)通過(guò)檢測(cè)線粒體凋亡通路上多種蛋白表達(dá)變化,推測(cè)DHA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與激活線粒體凋亡通路有關(guān)。(3)DHA能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞的侵襲并降低其遷移