CXCL5對肝癌細胞遷移侵襲的影響及其機制.pdf

1、背景與目的:
　　趨化因子以自分泌和旁分泌的方式作用于腫瘤細胞，參與腫瘤細胞基因型和表型的改變，以及腫瘤微環(huán)境的形成，從而促進腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究著重探索與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的趨化因子，鑒定關(guān)鍵趨化因子CXCL5對肝癌細胞遷移侵襲的影響，并進一步探討其信號傳導(dǎo)機制，為肝癌的診斷和治療提供新的線索。
　　方法:
　　利用qRT-PCR芯片技術(shù)篩選高、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞（HCCLM3和HepG2）中表達差異的趨化因子;采

2、用RT-PCR和ELISA方法檢測肝癌細胞中關(guān)鍵趨化因子的mRNA和蛋白質(zhì)水平;利用免疫細胞化學(xué)方法觀察肝癌細胞中CXCR2的表達情況;利用Lipofectamin2000將小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染入肝癌細胞，下調(diào)CXCL5水平;利用劃痕實驗和Transwell小室法觀察肝癌細胞的遷移和侵襲能力;利用Western blot檢測MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達情況;利用CXCR2抑制劑SB225002和MEK抑制劑U0126分別阻

3、斷CXCR2和ERK/MAPK信號通路的激活。
　　結(jié)果:
　　(1)qRT-PCR芯片顯示高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞(HCCLM3)和低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞(HepG2)中存在多個差異表達的趨化因子，其中下調(diào)的有CXCL1、CXCL3、IL-1A、CCL2等14個，上調(diào)的有CXCL5、CXCL6、IL-8等14個。CXCL5在高、低轉(zhuǎn)移潛能細胞中相差1000余倍。
　　(2)根據(jù)芯片結(jié)果及文獻報道，選取其中六個趨化因子(CXCL

4、1、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CCL2和IL-1A)，在四種轉(zhuǎn)移潛能依次遞增的肝癌細胞系（HepG2、SMMC7721、MHCC97L和MHCC97H）中進行RT-PCR驗證。結(jié)果示，除CXCL3外，其余五種趨化因子驗證結(jié)果與芯片一致，CXCL5編碼基因的差異水平仍最為顯著。
　　(3)利用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中CXCL5的蛋白水平。結(jié)果示HepG2、SMMC7721、MHCC97L和MHCC97H中CXCL

5、5的分泌量分別為:22.21±0.48、25.74±1.40、82.78±3.23、98.85±1.73(F=393.48，P=0.000)，說明高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系中CXCL5蛋白水平亦升高(P＜0.001)。
　　(4)免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，肝癌細胞表達CXCR2，主要存在于細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)，細胞核未被特異性染色。PBS對照組未見免疫染色。
　　(5)選擇高表達CXCL5的MHCC97H進行干擾試驗。當(dāng)Lipofectame

6、2000和siRNA按照1∶20的比例轉(zhuǎn)染MHCC97H時，轉(zhuǎn)染效率可達70％以上。利用RT-PCR和ELISA比較三種CXCL5-siRNA的干擾效率，發(fā)現(xiàn)siRNA-313的干擾效率最高。收集干擾72小時后的培養(yǎng)上清液進行細胞遷移和侵襲實驗。結(jié)果顯示對照組、siRNA-NC組和siRNA-313組遷移細胞數(shù)分別為21.73±0.26、20.47±0.38、11.07±0.52、(F=68.90，P=0.000)。侵襲細胞數(shù)分別為8.

7、90±0.46、8.1±0.38、3.73±0.18(F=16.40，P=0.007)。siRNA-313組與其余兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。說明CXCL5沉默后的培養(yǎng)上清液中CXCL5的含量低，趨化肝癌細胞遷移和侵襲的能力也隨之降低。
　　(6)選擇低表達CXCL5的HepG2作為外源性CXCL5刺激實驗的研究對象。結(jié)果示CXCL5能顯著促進HepG2體外遷移和侵襲能力，此作用具有濃度依賴性，CXCR2抑制劑S

8、B225002能夠降低此作用。說明CXCL5可能通過與CXCR2結(jié)合發(fā)揮作用。
　　(7) Western blot結(jié)果顯示，CXCL5刺激肝癌細胞之后，MAPK/ERK、MAPK/p-38、MAPK/JNK三條信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-ERK、p-p38、p-JNK表達水平均升高，以p-ERK變化最顯著;利用U0126阻斷ERK/MAPK通路之后，CXCL5趨化肝癌細胞遷移和侵襲的細胞數(shù)目明顯下降。說明CXCL5/CXCR2通過激