miR-10a對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響及其靶基因的確定.pdf

1、目的:
　　 腫瘤的遷移和侵襲是多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜生命現(xiàn)象，其發(fā)生的隱蔽性和不可預(yù)測(cè)性是腫瘤患者治療過(guò)程中最重要的難題，也是威脅腫瘤患者生命的最重要原因。目前，對(duì)于其發(fā)生機(jī)制的研究已取得了很多的成就，microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)又使這一領(lǐng)域的研究有所擴(kuò)展。miRNA屬于小RNA分子家族，能通過(guò)與3'非翻譯區(qū)(3'UTR)帶有互補(bǔ)序列的靶基因互補(bǔ)結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而發(fā)揮對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控

2、作用。研究表明，miRNA的調(diào)節(jié)作用涵蓋了生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞凋亡，造血細(xì)胞分化，脂肪代謝等多種生命過(guò)程。在腫瘤組織中，也存在miRNA的差異表達(dá)，提示人們miRNA可能參與腫瘤的某些生物學(xué)特性的形成。此研究的目的即探尋是否miRNA參與了肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控過(guò)程，這一調(diào)控過(guò)程是通過(guò)哪些基因?qū)崿F(xiàn)的。
　　 方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明miR-10a是抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要miRNA，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP14的表

3、達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。為了研究miR-10a對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了深入的研究。細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)或封閉掉miR-10a后，細(xì)胞的遷移及侵襲能力發(fā)生了變化。同時(shí)用MTT，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-10a對(duì)細(xì)胞活性及增殖能力的影響。在確認(rèn)miR-10a與肝癌細(xì)胞遷移及侵襲表型相關(guān)之后，我們通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因，挑選了其中一個(gè)與腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)的靶基因EPHA4為研究對(duì)象。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了帶

4、有EPHA4的3'UTR miR-10a靶位點(diǎn)的報(bào)告基因載體，在肝癌細(xì)胞系中檢測(cè)miR-10a對(duì)報(bào)告基因表達(dá)水平的影響，來(lái)驗(yàn)證EPHA4是否為miR-10a的靶基因。此后，又通過(guò)Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)了miR-10a對(duì)EPHA4的mRNA和蛋白水平的影響。構(gòu)建的質(zhì)粒pSilenser/EPHA4-shRNA對(duì)細(xì)胞表型的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證EPHA4是否為miR-10a的靶基因。
　　 結(jié)果:

5、r>　　 細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-10a能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，封閉掉miR-10a能降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且并不影響細(xì)胞的活性及增殖能力。報(bào)告基因載體實(shí)驗(yàn)表明miR-10a能夠抑制帶有EPHA4靶位點(diǎn)的報(bào)告基因表達(dá)載體的表達(dá)。Real-time PCR和Western blot的結(jié)果表明miR-10a能夠影響EPHA4的mRNA和蛋白水平。pSilenser/EPHA4-shRNA質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞表型的影響