

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文檔簡介
1、背景和目的:
微小 RNA(microRNA,miRNA)是一類大小約22個核苷酸的保守非編碼RNA,能夠與下游靶基因mRNA的3’UTR堿基配對并引導(dǎo)基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯,參與生物合成和腫瘤的發(fā)展。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個多步驟多因素參與的復(fù)雜過程。迄今為止,
2、對肝細胞癌組織進行miRN A分子差異表達譜分析的研究也十分有限。目前已有研究表明miR-18a在肝癌組織的表達水平較癌旁正常組織高。我們前期研究結(jié)果顯示肝癌患者血清中miR-18a水平較健康人高。本課題擬在此基礎(chǔ)上進一步探討miR-18a對肝癌細胞侵襲遷移的影響并闡明其作用機制。
方法:
1、用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將miR-18a阻遏物(inhib itor),miR-18a阻遏物陰性對照組(inhibitor n
3、egative control,inhibitor NC)分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2及HepG2.2.15。通過transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力;采用transwell遷移實驗及劃痕實驗檢測細胞遷移能力。
2、生物信息學方法預(yù)測Dicer1為miR-18a的靶基因。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法分別將靶向沉默Dicer的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)與miR-18a inhibito
4、r共轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2及HepG2.2.15,并設(shè)置Dicer siRNA的陰性對照(negative control siRNA,siRNANC)與miR-18a inhibitor共轉(zhuǎn)染為對照組,以及miR-18a inhibitor組、inhibitor NC對照組,transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力,transwell遷移實驗及劃痕實驗檢測細胞遷移能力,westem blot檢測Dicer l蛋白表達,觀察miR-
5、18a對肝癌細胞侵襲、遷移的影響是否通過抑制Dicer1表達發(fā)揮。
結(jié)果:
1、Tra ns we ll侵襲及遷移實驗結(jié)果顯示:與對照組比較,轉(zhuǎn)染miR-18a inhib itor72h后,HepG2及HepG2.2.15細胞侵襲和遷移能力均顯著降低,平均每高倍視野(×200)侵出小室的細胞數(shù)與NC組相比均顯著減少,HepG2細胞miR-18a inhibitor組分別為NC組的0.410倍、0.446倍(P<0.
6、01);HepG2.2.15細胞miR-18ainhibitor組分別為NC組的0.565倍、0.602倍(P<0.01)。
劃痕實驗顯示HepG2及HepG2.2.15細胞劃痕后24h、48h、72h,miR-18ainhibitor組劃痕愈合速度明顯慢于NC組(均 P<0.05)。
2、Western blot檢測及transwell侵襲及遷移實驗結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染inhibitorNC組相比,轉(zhuǎn)染miR-18ai
7、nhibitor組48h后細胞中Dicer1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),transwell顯示細胞侵襲和遷移能力均顯著減弱,平均每高倍視野(×200)侵出小室的細胞數(shù)與NC組相比均顯著減少,HepG2細胞miR-18ainhibitor組分別為NC組的0.462倍、0.460倍(P<0.01);HepG2.2.15細胞miR-18ainhibitor組分別為NC組的0.574倍、0.579倍(P<0.01)。與共轉(zhuǎn)染siRNA
8、NC+miR-18ainhibitor組相比,共轉(zhuǎn)染DicersiRNA+miR-18ainhibitor48h后細胞中Dicer1蛋白表達水平顯著降低(P<0.01),同時transwell顯示細胞侵襲和遷移能力均顯著增強,平均每高倍視野(×200)侵出小室的細胞數(shù)與siRNA-NC+miR-18ainhibitor組相比均顯著增多,HepG2細胞DicersiRNA+miR-18ainhibitor組分別為siRNA-NC+miR-
9、18ainhibitor組的2.079倍、2.193倍(P<0.01);HepG2.2.15細胞DicersiRNA+miR-18ainhibitor組分別為siRNA-NC+miR-18ainhibitor組的1.619倍、1.777倍(P<0.01)。劃痕實驗顯示HepG2及HepG2.2.15細胞劃痕后24h、48h、72h,共轉(zhuǎn)染DicersiRNA+miR-18ainhibitor組劃痕愈合速度明顯快于siRNANC+miR-
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