miR-338抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移能力的研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌是全球腫瘤病人死亡的主要原因之一，其中一半以上發(fā)生在中國(guó)。肝癌總的5年生存率不足5％。肝癌病人確診越晚，其預(yù)后效果越差。由于肝癌的晚期診斷嚴(yán)重限制了肝癌治療手段的選擇，因此肝癌的早期發(fā)現(xiàn)非常重要。闡明肝癌發(fā)生機(jī)制將有助于尋找早期診斷肝癌的腫瘤標(biāo)記物。 MicroRNA是一類可負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的非蛋白編碼的RNA家族，能通過(guò)與mRNA分子相互作用阻遏蛋白質(zhì)翻譯或?qū)е翿NA的降解。成熟的miRNA是一種約19-25nt長(zhǎng)

2、的單鏈RNA分子，可通過(guò)完全或不完全堿基配對(duì)與mRNA分子3'UTR端相結(jié)合，從而抑制靶基因的翻譯，參與細(xì)胞一系列的重要過(guò)程，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡。越來(lái)越多的研究表明腫瘤細(xì)胞與癌旁組織來(lái)源細(xì)胞間miRNA表達(dá)譜具有明顯差異，miRNA表達(dá)譜可將肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病與臨近正常組織分開(kāi)。重要的是發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的miRNA定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的染色體區(qū)域和脆性位點(diǎn)，提示miRNA在腫瘤形成過(guò)程中可能扮演著重要的角色。m

3、iRNA在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病相、Burkitt's淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌與肝癌中均有異常表達(dá)。此外不同表達(dá)的miRNA還與肺癌病人手術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)，且可以作為肺癌診斷與預(yù)后的分子標(biāo)記物。miRNA還可能具有癌基因或抑癌基因的作用。這些研究均說(shuō)明miRNA有望成為新的腫瘤標(biāo)記物用于腫瘤診斷與預(yù)后評(píng)價(jià)。因此研究與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNA表達(dá)譜的變化，探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，這對(duì)肝癌的早期診斷和及時(shí)防治具有非常重要的意義。

4、 在本研究中第一部分我們擬通過(guò)檢測(cè)臨床肝癌標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本中miRNA的表達(dá)譜，結(jié)合臨床病例資料，總結(jié)miRNA差異表達(dá)狀況與肝癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，并以定量RT-PCR加以驗(yàn)證。在研究第二、三部分對(duì)篩選出的興趣miRNA，以定量RT-PCR和Western-blotting分析其功能、及其相對(duì)應(yīng)的靶mRNA和目的蛋白表達(dá)狀況，探討其在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。 第一部分利用液相芯片技術(shù)進(jìn)行肝癌miRNA表達(dá)譜的研

5、究：miR-338在肝癌組織中下調(diào)表達(dá) 目的：目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA在許多腫瘤中失調(diào)表達(dá)，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的研究尚不多，本部分探討miRNA在肝癌中的表達(dá)譜，以便更好理解肝癌的發(fā)生機(jī)制。 方法：通過(guò)液相芯片技術(shù)分析20對(duì)肝癌癌組織與其癌旁組織中114種miRNA表達(dá)譜差異。應(yīng)用Hierarchical Cluster軟件將31種差異表達(dá)的miRNA對(duì)20例患者進(jìn)行聚類分析，利用

6、Real-time RT-PCR在另外36對(duì)肝癌癌組織中驗(yàn)證miR-338下調(diào)表達(dá)及其與肝癌臨床參數(shù)的相關(guān)性。 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中，液相芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示31種miRNA在肝癌組織與非肝癌組織間呈現(xiàn)差異表達(dá)，每種miRNA表達(dá)數(shù)值均與5S表達(dá)值相比進(jìn)行標(biāo)化。其中12種miRNA在癌組織中相對(duì)于在癌旁組織中上調(diào)表達(dá)，19種miRNA在癌組織中下調(diào)表達(dá)。應(yīng)用Hierarchical Cluster軟件將31種差異表達(dá)miRNA對(duì)20

7、例患者進(jìn)行聚類時(shí)，可基本將肝癌組織與毗鄰癌旁組織分開(kāi)。miR-338可明顯將20例肝癌病人分成兩組。根據(jù)miR-338表達(dá)譜，再結(jié)合以上臨床病例詳細(xì)資料分析、發(fā)現(xiàn)：miR-338下調(diào)表達(dá)程度還與HCC惡性程度、腫瘤分化程度、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移及門(mén)靜脈癌栓有關(guān)，miR—338下調(diào)程度在有血管侵襲與無(wú)血管侵襲病例組有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.005)。miR—338在腫瘤>5cm組中表達(dá)更低與腫瘤<5cm組相比(P<0.001)；與無(wú)明顯肝內(nèi)轉(zhuǎn)

8、移病例中比較，miR—338在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病例中表達(dá)更低；miR—338的表達(dá)隨著肝癌腫瘤級(jí)別與分化程度的升高而逐近降低。但與患者性別、AFP、HBsAg、是否合并肝硬變均無(wú)關(guān)。利用Real—time RT—PCR檢測(cè)miR—338在另外36例肝癌病人癌組織與非癌組織中，轉(zhuǎn)移癌組織與非轉(zhuǎn)移癌組織、不同腫瘤級(jí)別間的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)：miR—338在癌組織中的表達(dá)量明顯低于非腫瘤組織、在伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中低于非轉(zhuǎn)移性癌組織、miR—338的表達(dá)

9、量隨著腫瘤級(jí)別的增加逐近降低。 結(jié)論：肝癌組織與癌旁組織之間存在miRNA差異表達(dá)，其中miR—338下調(diào)表達(dá)程度還與肝惡性行為相關(guān)。如果miRNA表達(dá)譜可以用于診斷腫瘤，那么液相芯片技術(shù)將有可能成為一種大規(guī)模診斷腫瘤的方法。 第二部分MiR-338通過(guò)下調(diào)SMO抑制肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移 目的：我們研究的第一部分已經(jīng)證明了miR—338與HCC的相關(guān)性，但是它在HCC中的作用機(jī)制尚不清楚。由于目前還沒(méi)有miR—3

10、38調(diào)控哪些信號(hào)通路及其在腫瘤發(fā)生中的功能研究，故本研究對(duì)在HCC中下調(diào)表達(dá)的miR—338進(jìn)行更深入的研究。 方法：應(yīng)用分子生物學(xué)方法預(yù)測(cè)miR—338靶基因。常規(guī)培養(yǎng)人肝細(xì)胞(BEL—7402，SMMC—7721，Skhep-1，PLC，Hep3B，Huh7和LO2)。定量RT—PCR檢測(cè)SMO、GLI1、MMP9的表達(dá)量。進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，肝癌細(xì)胞的增殖能力與遷移遷襲能力的改變分別應(yīng)用MTT與Transwell及劃痕實(shí)

11、驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用Hoechst33258和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的改變。Western—blotting用于檢測(cè)SMO、GLII、MMP9蛋白水平的改變。 結(jié)果：采用TargetScan和miRanda網(wǎng)站預(yù)測(cè)到SMO為miR—338的靶基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR—338在肝癌細(xì)胞株中發(fā)生不同程度的下調(diào)。而伴隨著SMO、GLI1表達(dá)量的上升，SMO是Hh信號(hào)通路的控制“開(kāi)關(guān)”，SMO異常過(guò)表達(dá)將激活其下游的

12、GLI1轉(zhuǎn)錄因子，從而激活Hh信號(hào)通路。Hh信號(hào)通路參與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。顯然，在肝腫瘤細(xì)胞中miR—338的表達(dá)與SMO的表達(dá)、與Hh信號(hào)通路的活化呈負(fù)相關(guān)。我們?cè)赟MMC—7721和Skhep-1細(xì)胞株中對(duì)miR—338和SMO關(guān)系進(jìn)行更深入的研究。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre—miR—338到這兩種細(xì)胞中恢復(fù)miR—338的表達(dá)將劑量依賴性地降低SMO mRNA和蛋白的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染inhibitor—miR—338到這兩種細(xì)胞中抑制miR

13、—338的表達(dá)將劑量依賴性地升高SMOmRNA和蛋白的表達(dá)。這說(shuō)明miR—338可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制SMO的表達(dá)。 有趣地是提高細(xì)胞內(nèi)miR—338表達(dá)抑制SMO、GLI1 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)減弱了細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力。也降低了GLI1下游因子MMP9的mRNA及蛋白的表達(dá)，MMP9參與細(xì)胞的遷移與遷襲過(guò)程。與之相反的是，抑制細(xì)胞內(nèi)miR—338表達(dá)則促進(jìn)SMO、GLI1 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖、

14、侵襲與轉(zhuǎn)移能力。也提高了GLI1下游因子MMP9的mRNA及蛋白的表達(dá)。而使用SMO特異性抑制劑cyc(也是Hh信號(hào)通路抑制劑)可以逆轉(zhuǎn)inhibitor—miR—338提高肝癌細(xì)胞增殖與遷襲能力的作用。同時(shí)inhibitor—miR—338對(duì)Glil和MMP9表達(dá)升高的效應(yīng)也被逆轉(zhuǎn)。而在肝癌細(xì)胞中單獨(dú)使用cyc，則癌細(xì)胞增殖與遷襲能力被抑制，發(fā)生與轉(zhuǎn)染pre—miR—338到細(xì)胞中相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR—338

15、對(duì)SMMC—771和Skhep1細(xì)胞周期及凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre—miR—338增加細(xì)胞內(nèi)miR—338表達(dá)之后，G0/G1期延長(zhǎng)，S期相應(yīng)縮短；與之相反的是轉(zhuǎn)染inhibitor—miR—338降低細(xì)胞內(nèi)miR—338表達(dá)之后，G0/G1期縮短，S期相應(yīng)延長(zhǎng)；而使用cyc后，則取消inhibitor—miR—338對(duì)癌細(xì)胞周期的影響。無(wú)論轉(zhuǎn)染pre—miR—338還是inhibitor—miR—338都對(duì)G2/M期無(wú)明顯影響。

16、且Hoechst33258染色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論轉(zhuǎn)染pre—miR—338還是inhibitor—miR—338，肝癌細(xì)胞均未出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等典型的凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論：以上結(jié)果證實(shí)miR—338下調(diào)SMO基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制Hh信號(hào)通路，及其下游的轉(zhuǎn)錄因子GLI1和MMP9。miR—338可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，可以將細(xì)胞周期阻止在G0/G1期，但對(duì)其凋亡無(wú)影響。這些結(jié)果說(shuō)明在肝癌中異常表達(dá)的miR—338通過(guò)

17、抑制SMO，進(jìn)而作用于Hh信號(hào)通路改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為如細(xì)胞增殖、遷移與遷襲能力。綜上說(shuō)明miR—338在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，這將為HCC的診斷與治療帶來(lái)新的曙光。 第三部分MiR-338靶向調(diào)節(jié)基因SMO的機(jī)制研究 目的：探討肝癌細(xì)胞中miR—338對(duì)SMO的作用機(jī)制。 方法：構(gòu)建含SMO3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告載體，與miR—338表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素酶活性。