miR-217負(fù)調(diào)控MTDH抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲等作用機制的研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞癌（肝癌）在全球惡性腫瘤中發(fā)病率居第五位，死亡率居第三位。由于早期無特異表現(xiàn)、治療后易復(fù)發(fā)，肝癌病人整體預(yù)后較差，是威脅人類健康的重大醫(yī)療問題。因此，尋找用于精準(zhǔn)早期診斷的的生物標(biāo)志物和有效的治療靶點是肝癌研究的重點。近年來發(fā)現(xiàn)miR-217已被證實在胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，但是在肝癌中miR-217的作用機制仍不明確。
　　異黏蛋白(MTDH)是一種含582個氨基酸的單跨膜蛋白，其在多種腫瘤中

2、均有異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展正相關(guān)。MTDH基因的表達(dá)還與癌癥進(jìn)展的階段、分期、以及預(yù)后相關(guān)。MTDH基因通過調(diào)控癌癥過程中的多個信號通路參與癌癥進(jìn)程，因此MTDH是一個潛在的治療靶點。目前對于MTDH在肝癌中的表達(dá)調(diào)控機制研究還比較少。
　　miRNA能通過間接或者直接調(diào)控MTDH的的表達(dá)，在結(jié)直腸癌中是miRNA間接調(diào)控MTDH，在乳腺癌、人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中都是miRNA直接調(diào)控MTDH的實例，然而對于miR-2

3、17與MTDH的關(guān)系尚不明確。通過對患者肝癌組織和HepG2細(xì)胞的研究，探索miRNA-217介導(dǎo)MTDH在肝癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)研究及作用機制。
　　目的：
　　1.檢測miR-217和MTDH在肝癌和癌旁組織中的差異性表達(dá)，探討其相關(guān)性;
　　2.驗證miR-217與MTDH基因的靶向作用關(guān)系;
　　3.檢測miR-217對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.自南

4、方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科收集20例肝癌和癌旁組織，分別采用實時熒光定量PCR及Western Blot檢測其中miR-217、MTDH mRNA和蛋白水平的表達(dá);
　　2.通過TargetScan預(yù)測miR-217與MTDH的結(jié)合位點，分別構(gòu)建MTDH基因3'-UTR區(qū)的野生型和突變型熒光素酶報告質(zhì)粒，與miR-217mimics共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測其熒光表達(dá)變化。在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-217，通過實時熒光定量PC

5、R、Western Blot及免疫熒光分別檢測細(xì)胞中MTDH的mRNA和蛋白的表達(dá)變化，驗證miR-217對MTDH的靶向作用;
　　3.在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-217，通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實驗檢測miR-217對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)特性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在20例肝癌和癌旁組織中，miR-217在肝癌中的表達(dá)量較癌旁組織明顯降低(40％)，而MTDH mRNA

6、在肝癌中較癌旁組織表達(dá)高近一倍，MTDH蛋白水平的表達(dá)mRNA水平一致。
　　2.通過轉(zhuǎn)染miR-217mimics，成功在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-217，miR-217顯著抑制野生型MTDH3'-UTR載體的熒光強度，對突變型MTDH3'-UTR載體無明顯作用。過表達(dá)miR-217明顯抑制HepG2細(xì)胞中MTDH mRNA和蛋白的表達(dá)，證明了miR-217直接靶向于MTDH基因的3'-UTR區(qū)，從而抑制MTDH基因的表達(dá)。

7、
　　3.在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-217，通過CCK-8實驗和流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn):較之空白及陰性對照組，過表達(dá)miR-217能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并增加處于G1期、減少S期的HepG2細(xì)胞;同時，過表達(dá)miR-217，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡;Transwell實驗結(jié)果表明，過表達(dá)miR-217后，轉(zhuǎn)移到下室中的細(xì)胞明顯減少，證明miR-217顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論：
　　1