Hsa-miR-486-5p抑制肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一。盡管手術(shù)和肝移植是首選的治療策略,但其適應(yīng)癥范圍有限。化療藥物和靶向藥物能有效殺傷肝癌細(xì)胞,但存在副作用和耐藥性問題。因此,進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制,尋找HCC早期診斷指標(biāo)和藥物新靶點(diǎn)是這個(gè)領(lǐng)域一亟待解決的醫(yī)學(xué)課題。
　　MicroRNA(miR)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,在包括癌癥等的病理生理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。Hsa-miR-

2、486-5p在胎肝中首先克隆,但其在肝細(xì)胞癌(HCC)中有何作用未有報(bào)道。本論文將闡明hsa-miR-486-5p在HCC的作用及初步探討其機(jī)制。為發(fā)掘HCC早期診斷指標(biāo)和藥物新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本課題首先檢測了hsa-miR-486-5p、miR-17-92等microRNAs在HCC細(xì)胞系、組織、血清的表達(dá)水平;檢測了hsa-miR-486-5p的宿主基因Ank1在HCC癌組織及癌旁組織的表達(dá)。其次,構(gòu)建及鑒定hsa-m

3、iR-486-5p等microRNA的慢病毒載體,包裝并純化hsa-miR-486-5p等相關(guān)慢病毒。利用慢病毒感染HCC細(xì)胞系,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),檢測hsa-miR-486-5p等microRNA在HCC的增殖、凋亡、周期、遷移中的作用;繼而從體內(nèi)闡明hsa-miR-486-5p在HCC的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。最后利用microRNA預(yù)測網(wǎng)站篩選與HCC細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)的靶基因,構(gòu)建并鑒定靶基因3’UTR熒光素酶報(bào)告載體,應(yīng)用雙熒光

4、素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與靶基因的相互作用;設(shè)計(jì)并合成靶基因siRNA,敲減靶基因模擬hsa-miR-486-5p的抑制靶基因作用,檢測靶基因siRNA對(duì)HCC的作用,從靶基因水平探討hsa-miR-486-5p在HCC的作用機(jī)制。
　　一、肝癌細(xì)胞microRNAs表達(dá)研究。
　　我們利用microRNAarray芯片檢測了不同細(xì)胞株microRNAs的表達(dá)差異;利用qRT-PCR的方法檢測了hsa-miR-486-5p等在肝癌細(xì)

5、胞系HepG2、SMMC-7721、97L、97H、LM3的表達(dá);檢測了HCC患者癌組織及癌旁組織中hsa-miR-486-5p及其宿主基因Ank1的表達(dá);檢測了HCC患者及普通體檢人群血清中hsa-miR-486-5p的表達(dá)。
　　MicroRNAarray芯片結(jié)果顯示LM3相對(duì)于SMMC-7721細(xì)胞,表達(dá)升高2倍以上的microRNA有84個(gè),其中包括hsa-miR-486-5p、hsa-miR-106b-93-25等。肝癌

6、細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721、97L、97H、LM3相對(duì)于肝癌癌旁組織,hsa-miR-486-5p表達(dá)明顯下降。hsa-miR-106b-93-25在SMMC-7721、97L、97H、LM3各細(xì)胞系表達(dá)有差異。hsa-miR-155在幾種肝癌細(xì)胞表達(dá)沒有差異。hsa-miR-486-5p在大部分HCC患者的癌組織都表達(dá)下調(diào),并且hsa-miR-486-5p的宿主基因Ank1也表達(dá)下降。hsa-miR-106b-93-25、h

7、sa-miR-17-92及hsa-miR-155在HCC的癌組織和相對(duì)應(yīng)癌旁組織中表達(dá)沒有明顯規(guī)律。HCC患者血清中hsa-miR-486-5p的表達(dá)低于普通健康體檢人員血清的表達(dá)水平。
　　根據(jù)這部分結(jié)果我們得出如下結(jié)論:hsa-miR-486-5p在HCC細(xì)胞、組織及血清中表達(dá)下調(diào);其宿主基因Ank1在HCC組織中也表達(dá)下降。其他幾種microRNAs的表達(dá)沒有明顯規(guī)律。
　　二、hsa-miR-486-5p抑制肝癌細(xì)胞

8、增殖及侵襲。
　　我們利用分子克隆的方法將hsa-miR-486-5p構(gòu)建于pHIV7慢病毒載體并鑒定。應(yīng)用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝并純化病毒,利用流式細(xì)胞儀和GFP標(biāo)志測定慢病毒滴度。之后,利用慢病毒感染和流式分選的方式獲得穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株。利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,應(yīng)用Dye670及CCK-8檢測hsa-miR-486-5p等對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用平板克隆形成方法檢測hsa-miR-486-5p對(duì)HCC細(xì)胞克隆形成能

9、力的影響;應(yīng)用AVNIX和PI雙標(biāo)法檢測hsa-miR-486-5p對(duì)HCC細(xì)胞凋亡的影響;應(yīng)用劃痕和遷移的方法檢測hsa-miR-486-5p等對(duì)HCC細(xì)胞遷移的影響;應(yīng)用Westernblot和免疫共聚焦的方法檢測hsa-miR-486-5p對(duì)HCC細(xì)胞表皮Marker變化的影響;利用裸鼠荷瘤動(dòng)物模型及病理分析檢測hsa-miR-486-5p在體內(nèi)對(duì)HCC的影響。
　　結(jié)果顯示成功獲得hsa-miR-486-5p及相應(yīng)對(duì)照載體

10、等慢病毒,滴度測定顯示5×107pfu/ml以上,可用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。用Dye670染料法證實(shí)hsa-miR-486-5p可抑制HCC細(xì)胞的增殖,但CCK-8法檢測僅有抑制增殖趨勢,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)證實(shí)hsa-miR-486-5p抑制HCC細(xì)胞克隆形成。應(yīng)用AnnexinV和PI雙標(biāo)法檢測到hsa-miR-486-5p對(duì)HCC細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用,能增加化療藥索拉非尼的敏感性。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa-miR-486-5p能抑制HCC

11、細(xì)胞劃痕的愈合。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa-miR-486-5p能在體外抑制HCC細(xì)胞遷移。Westernblot和免疫共聚焦的方法結(jié)果顯示hsa-miR-486-5p可以使SMMC-7721細(xì)胞表皮上皮Marker如E-cadherin等表達(dá)增強(qiáng),而使間質(zhì)Marker如vimentin等表達(dá)減弱。利用裸鼠荷瘤模型和病理切片分析,hsa-miR-486-5p在體內(nèi)延長成瘤時(shí)間,對(duì)腫瘤的生長的抑制沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移不

12、明顯。
　　根據(jù)這部分結(jié)果我們得出如下結(jié)論:hsa-miR-486-5p抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移生物學(xué)特性。
　　三、hsa-miR-486-5p在肝癌細(xì)胞中的靶基因及作用機(jī)制研究。
　　我們利用蛋白芯片方法檢測hsa-miR-486-5p過表達(dá)后的基因表達(dá)差異;利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析與HCC細(xì)胞生物學(xué)改變相關(guān)的靶基因;利用分子克隆方法構(gòu)建靶基因3′UTR熒光素酶報(bào)告載體并鑒定,之后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測方法篩選hs

13、a-miR-486-5p的相關(guān)靶基因;利用siRNA干涉方法檢測靶基因CITRON(CIT)和CLDN10對(duì)HCC生物學(xué)特性的影響。本文利用prism5對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　蛋白芯片檢測結(jié)果與靶基因預(yù)測網(wǎng)站提供信息交集,顯示差異基因?yàn)?IR10RA、STAT6、APP、GRIP1、ESR2、CXADR。利用Targetscan等預(yù)測網(wǎng)站分析CIT、CLDN10、TWF1、AFF3、PLAGL2、SRF、DCBLD2等為

14、相關(guān)靶基因;成功構(gòu)建靶基因3′UTR熒光素酶報(bào)告載體,用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測靶基因CIT、CLDN10、TWF1、AFF3可與hsa-miR-486-5p結(jié)合。分析上述各基因已報(bào)道的功能,并用mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步篩選靶基因。最后選定CIT和CLDN10。用小RNA干擾的方法證實(shí)CIT表達(dá)下調(diào)后(模擬hsa-miR-486-5p的作用)HCC細(xì)胞增殖能力減弱。用小RNA干擾的方法證實(shí)CLDN10表達(dá)下調(diào)后(模擬hsa-miR-48

15、6-5p的作用)HCC細(xì)胞遷移能力減弱。
　　根據(jù)這部分結(jié)果我們得出如下結(jié)論:hsa-miR-486-5p通過抑制CIT的表達(dá)而抑制HCC細(xì)胞增殖;過抑制CLDN10的表達(dá)而抑制HCC細(xì)胞遷移。
　　總之,本課題首次闡明hsa-miR-486-5p在HCC中表達(dá)下調(diào);其抑制HCC細(xì)胞增殖和遷移;hsa-miR-486-5p作為一個(gè)HCC抑癌基因,其靶基因?yàn)镃IT和CLDN10。本課題更深入地闡明了HCC的發(fā)病機(jī)制,同時(shí)研究了