慢病毒載體介導(dǎo)的miR-124過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究在胃癌細(xì)胞中利用慢病毒載體系統(tǒng)過表達(dá)miR-124，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞生長、侵襲的影響；并探究其機(jī)制，為miR-124在胃癌臨床治療中的潛在應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　?、舚RT-PCR檢測(cè)胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織中miR-124的表達(dá)水平；MSP檢測(cè)了胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織中miR-124 DNA的三個(gè)CPG位點(diǎn)甲基化水平。⑵構(gòu)建過表達(dá)人 miR-124基因的慢病毒表達(dá)載體（Lent

2、i-miR-124），與慢病毒包裝質(zhì)粒（pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝慢病毒，然后分別將病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá) miR-124的胃癌細(xì)胞株。⑶CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-124對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS增殖的影響；Transwell試驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-124對(duì)SGC-7901和AGS細(xì)胞遷移和侵襲的影響。⑷向裸鼠皮下植入轉(zhuǎn)染過 Lenti-miR-124（

3、穩(wěn)定過表達(dá) miR-124的慢病毒載體）或Lenti-GFP（對(duì)照慢病毒載體）的SGC-7901細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠荷瘤模型；隨后觀察兩組裸鼠成瘤情況，記錄瘤塊體積。⑸Western Blotting檢測(cè)過表達(dá)miR-124對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901及AGS中JAG1及EZH2蛋白水平的影響，qRT-PCR檢測(cè)臨床人胃癌及癌旁樣本中JAG1及EZH2mRNA表達(dá)水平。⑹合成特異靶向JAG1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞；CCK-8

4、及Transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)siRNA干擾JAG1表達(dá)后對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長及遷移侵襲能力的影響。⑺慢病毒載體Lenti-shEZH2（前期構(gòu)建）轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞；CCK-8及Transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)干擾EZH2表達(dá)后對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長及遷移侵襲能力的影響。8、分別在過表達(dá)miR-124、敲除JAG1或EZH2的SGC-7901細(xì)胞中，采用Western Blotting檢測(cè)Fibronectin和Vim

5、entin蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　?、倥c癌旁組織相比，胃癌組織中miR-124表達(dá)顯著降低；miR-124基因三個(gè)CPG位點(diǎn)（miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3）的甲基化水平在胃癌組織中顯著高于癌旁正常胃組織。②CCK-8試驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-124抑制SGC-7901和AGS細(xì)胞的增殖；Transwell結(jié)果顯示過表達(dá)miR-124顯著抑制SGC-7901和AGS細(xì)胞的遷移和侵襲能力。③慢病

6、毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的miR-124過表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞裸鼠異位移植瘤的生長。④qRT-PCR結(jié)果顯示在胃癌新鮮組織中，JAG1及EZH2mRNA水平較相鄰正常胃組織顯著升高。⑤Western Blotting結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-124抑制JAG1和EZH2的蛋白表達(dá)。⑥CCK-8及Transwell結(jié)果顯示siRNA干擾JAG1或shEZH2干擾EZH2表達(dá)后均可抑制SGC-7901細(xì)胞生長并減弱其遷移侵襲能力。⑦Wester

7、n Blotting結(jié)果顯示在過表達(dá)miR-124、敲除JAG1或EZH2的SGC-7901細(xì)胞中，F(xiàn)ibronectin和Vimentin蛋白表達(dá)量下降。
　　結(jié)論：
　　miR-124基因在胃癌組織中存在廣泛的甲基化且表達(dá)下調(diào)。慢病毒載體介導(dǎo)的miR-124過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞生長，遷移和侵襲，并抑制胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力。JAG1和EZH2在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)miR-124可抑制JAG1和EZH2在胃癌細(xì)