人miR-147a真核表達載體的構(gòu)建及對肺癌細胞增殖、侵襲的影響.pdf

1、miRNA(microRNA)是真核細胞重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在細胞及生物的增殖凋亡、發(fā)育分化等過程中發(fā)揮重要作用，其功能異?？梢詫е露喾N病理狀態(tài)，包括腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。很多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了特異性的表達異常的miRNAs。目前認為，許多miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中，或者作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性，或者作為癌基因下調(diào)抑癌基因的活性，或者作為腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，其自身突變、缺失、易位及相互調(diào)控異常等還可導致相關(guān)基因異常表達，因此mi

2、RNA在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并可作為腫瘤診斷的新型分子標記物。miRNA在肺組織的發(fā)育中起重要作用，其異常表達與肺癌的進展過程具有密切的關(guān)系，因此篩選、鑒定肺癌特異的miRNA并闡明其在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制對于肺癌的診斷、預后和靶向治療有相當大的應用價值。我們在前期工作中，利用miRNA芯片分析9-順維甲酸對肺癌細胞株A549miRNA表達譜的影響，發(fā)現(xiàn)9-順維甲酸可上調(diào)miR-147a兩倍以上，并經(jīng)實時熒光

3、定量PCR證實，由此推測miR-147a可能具有腫瘤抑制作用。據(jù)此，我們構(gòu)建了miR-147a的表達載體pSilencer-147a，并對其在肺癌細胞A549中的表達和功能進行初步研究。
　　 目的:
　　 構(gòu)建人miR-147a真核表達載體，檢測其在肺腺癌細胞A549中的表達以及對A549細胞增殖能力、侵襲能力的影響。
　　 方法:
　　 1.重組質(zhì)粒載體pSilencer-147a的構(gòu)建:以A549細

4、胞總RNA為模板，RT-PCR擴增miR-147a的前體序列(pri-mir-147a)，插入表達載體pSilencer-CMV neo，構(gòu)建pSilencer-147a重組載體。
　　 2.qRT-PCR直接檢測外源性miR-147a的表達:A549細胞接種到25ml培養(yǎng)瓶中，使用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑，將pSilencer-147a轉(zhuǎn)染A549細胞，pSilencer空載體作對照。48h后收集細胞提取RNA，q

5、RT-PCR檢測外源性miR-147a的表達。
　　 3.重組質(zhì)粒載體pMIR-147aT的構(gòu)建:人工合成miR-147a的靶序列147aT，插入載體pMIR-REPORTTM Luciferase，構(gòu)建pMIR-147aT重組質(zhì)粒。
　　 4.報告基因分析間接檢測miR-147a的表達:將A549細胞接種到24孔板中，以pSilencer-147a和pMIR-147aT轉(zhuǎn)染A549細胞，對照組分別為:
　　 ①

6、轉(zhuǎn)染等量的pSilencer147a和pMIR-REPORT;
　　 ②轉(zhuǎn)染等量的pSilencer和pMIR-147aT;
　　 ③轉(zhuǎn)染等量的pSilencer和pMIR-REPORT。
　　 48h后收集細胞，裂解后檢測它們的相對熒光素酶活性。
　　 5.MTT分析檢測外源性miR-147a過表達對A549細胞增殖能力的影響:將A549細胞分別進行:
　　 ①不做任何處理;
　　 ②只

7、用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑處理;
　　 ③以X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染pSilencer質(zhì)粒;
　　 ④以X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染pSilencer-147a質(zhì)粒。
　　 然后將處理后的細胞接種到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24～96h，MTT法檢測其轉(zhuǎn)然后對細胞增殖能力的影響。
　　 6.Matrigel侵襲實驗檢測外源性miR-147a過表達對A549細胞侵襲能力的影響:A549細胞轉(zhuǎn)

8、染后，用無血清培養(yǎng)基將細胞接種到Transwell小室中，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，擦去未穿過的細胞，甲醇固定小室底部已穿過的細胞并以吉姆薩染液染色，計算侵襲效率。
　　 7.pGL4-AP1等重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建:人工合成腫瘤信號應答元件AP1，ELK1，cMYC，STAT3，F(xiàn)OXO，TCF，插入載體pGL4.23[luc2/minP] Vector中，構(gòu)建腫瘤信號應答元件-熒光素酶報告基因重組載體pGL4-AP1，pGL4-ELK1

9、，pGL4-cMYC, pGL4-STAT3, pGL4-FOXO, pGL4-TCF。
　　 8.報告基因分析檢測miR-147a對肺癌相關(guān)腫瘤信號途徑的影響:轉(zhuǎn)染前一天，A549細胞接種于48孔板，以X-tremeGENE HP分別將pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC，pGL4-STAT3，pGL4-FOXO，pGL4-TCF重組載體與pSilencer-147a進行共轉(zhuǎn)染，同時進行pSilencer空

10、載體和pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC，pGL4-STAT3，pGL4-FOXO，pGL4-TCF的共轉(zhuǎn)染作為對照。轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，檢測其相對熒光素酶活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建的pSilencer-147a重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性酶切和DNA測序證實構(gòu)建成功。
　　 2.pSilencer-147a轉(zhuǎn)染A549細胞后，qRT-PCR檢測到明顯的外源性miR-147a表達。

11、　　 3.構(gòu)建的pMIR-147aT重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性酶切和DNA測序證實構(gòu)建成功。
　　 4.報告基因分析結(jié)果證實，pSilencer-147a可在A549細胞中有效表達功能性的miR-147a。
　　 5.MTT結(jié)果顯示，miR-147a過表達可明顯抑制A549細胞的增殖，轉(zhuǎn)染48h，72h，和96h后，與對照組相比抑制效果分別達到13％，18％和30％。
　　 6.Matrigel侵襲實驗結(jié)果顯示，miR

12、-147a過表達可明顯抑制A549細胞的侵襲能力，轉(zhuǎn)染48 h后，與pSilencer4.1陰性對照組細胞相比，實驗組侵襲至Transwell小室底膜下表面的細胞數(shù)減少了72％。
　　 7.構(gòu)建的pGL4-AP1,pGL4-ELK1,pGL4-cMYC,pGL4-STAT3,pGL4-FOXO,pGL4-TCF重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性酶切和DNA測序證實構(gòu)建成功。
　　 8.報告基因分析結(jié)果顯示miR-147a過表達可顯著下調(diào)