2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的: 通過(guò)構(gòu)建SD大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BDNF,并將其轉(zhuǎn)染到胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)中,觀察轉(zhuǎn)染的NSCs中BDNF-GFP融合蛋白的表達(dá)、以及融合蛋白對(duì)NSCs細(xì)胞的增殖和分化的影響,為下一步進(jìn)行NSCs移植治療腦損傷及退行性腦疾病提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。 方法: 通過(guò)設(shè)計(jì)BDNF的特異性引物,用RT-PCR的方法從SD大鼠海馬組織中獲取BDNF基因序列片段,將其克隆入真核細(xì)胞表達(dá)載

2、體pEGFP-N1中,通過(guò)PCR、雙酶切鑒定后,選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。將構(gòu)建成功的pEGFP-N1-BDNF重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞和NSCs細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。用RT-PCR檢測(cè)BDNFmRNA表達(dá)情況;用免疫印跡、ELLAS法檢測(cè)BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)情況;用MTT比色法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究BDNF-GFP融合蛋白對(duì)NSCs細(xì)胞增殖和分化的影響。 結(jié)

3、果: 1.重組質(zhì)粒通過(guò)質(zhì)粒PCR、雙酶切后電泳顯示存在與BDNF目的基因大小相同的條帶,DNA測(cè)序結(jié)果顯示與Genebank公布的BDNF基因序列比較只有一個(gè)突變位點(diǎn),但不影響正常BDNF蛋白的表達(dá)。 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后,RT-PCR鑒定顯示只有轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的COS-7細(xì)胞有BDNF mRNA表達(dá):免疫印跡檢測(cè)顯示,僅轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的COS-7細(xì)胞有BDNF-GFP融合蛋白

4、表達(dá),在48h以未成熟BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)為主,在96h以成熟BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)為主。 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞后,RT-PCR鑒定顯示只有轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的NSCs細(xì)胞有BDNF mRNA表達(dá);ELLAS檢測(cè)顯示,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的NSCs細(xì)胞在72-96h分泌的BDNF-GFP融合蛋白的量達(dá)高峰;MTT結(jié)果提示BDNF-GFP融合蛋白有抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用;免疫細(xì)胞化學(xué)檢

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