重組逆轉錄病毒表達載體pLEGFP-BDNF的構建和在神經干細胞中表達的實驗研究.pdf

1、研究背景：阿爾茨海默病(AD)，也稱老年性癡呆，是腦神經元退變性疾病，其主要癥狀是進行性記憶力減退和認知障礙。隨著人口老化，AD發(fā)病增多，發(fā)病機制未明，目前尚無有效的治療方法，給家庭、社會帶來沉重負擔。因此，亟需研究尋找有效治療措施。 近年來，神經干細胞(NSCs)作為中樞神經系統(tǒng)移植、轉基因的細胞載體和損傷修復材料，利用神經干細胞進行移植治療，或通過病毒載體將目的基因導入神經干細胞，為神經系統(tǒng)退行性變和神經損傷的臨床治療帶來新

2、的曙光。NSCs能夠不斷分裂增殖、具有多分化潛能，可以分化成神經元、神經膠質細胞，在體內可以根據(jù)不同腦區(qū)的微環(huán)境分化成該區(qū)的神經細胞。這種新的細胞具有以下優(yōu)點：1．NSCs在腦中能根據(jù)其周圍微環(huán)境的誘導而分裂，分化成相應的細胞類型，其形態(tài)和功能與附近的宿主細胞非常類似，因而能部分補償損傷和死亡細胞的功能；2．中樞神經系統(tǒng)具備特殊的結構——血腦屏障，這使得淋巴細胞在正常情況下很難進入，因此不同個體之間，甚至是不同物種之間的NSCs移植都幾

3、乎沒有排異反應，大大拓寬了NSCs的來源；3．NSCs可以在體外根據(jù)不同的需要導入相應的外源基因，成為一種廣譜的細胞載體。 神經營養(yǎng)因子(NTFs)是由靶細胞分泌的一組特異性蛋白分子，有促進和維護神經元生長、存活、分化和執(zhí)行功能的作用。腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)是最主要的神經營養(yǎng)因子之一，對周圍神經系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)多種遞質神經元具有廣譜作用，具有很強的刺激和促進神經細胞生長、分化及促使損傷細胞修復的作用。文獻報道給予體外培

4、養(yǎng)的神經前體細胞加入BDNF 主要促其向神經元方向分化。但目前BDNF仍未能在神經系統(tǒng)疾病的臨床治療中應用，因為BDNF是天然的蛋白分子，難以通過血腦屏障，如何把足量的BDNF傳送到中樞神經系統(tǒng)損傷的適當部位仍存在困難，而且經常性的腦內注射給藥，有導致顱內新的損害或感染的可能。因此，基因轉染是目前能提供長期療效的治療方法，基因修飾的細胞腦內移植現(xiàn)已成為研究的重點。采用BDNF基因修飾NSCs，不僅可利用它對各種神經元的營養(yǎng)作用，而且可利

5、用它能夠促進NSCs主要向神經元方向分化的功能，使NSCs移植腦內后能更大限度地補償損傷和死亡的神經元，達到緩解和改善AD癥狀的目的。 目前常用的轉基因載體包括一些病毒載體(腺病毒、腺相關病毒等)和陽性脂質體，它們各有不同的特點，目前在轉導的細胞中適于作為短時期表達研究。逆轉錄病毒載體由于其結構和生命周期的原因，并由于已經除去了病毒復制所必須的包裝順序而不能復制，只能借助逆轉錄病毒包裝細胞，能穩(wěn)定地將外源基因插入和整合到宿豐細胞

6、基因組內，并隨細胞分裂而傳代，提供了一個高效的、穩(wěn)定的、長期的目的基因轉移手段，適于作為基因轉染的載體。 本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法從大鼠海馬組織總RNA擴增BDNF基因，構建含BDNF基因的重組逆轉錄病毒表達載體，將重組體導入神經干細胞，并進行BDNF表達的檢測及其生物活性鑒定，為探討NSCs基因治療AD動物模型奠定基礎。 方法： 1．RT-PCR技術獲取BDNF cDNA基因片段根據(jù)Ge

7、ne Bank上大鼠BDNF的cDNA功能全長序列，設計一對引物并導入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性內切酶酶切位點。 2．pLEGFP-BDNF重組質粒的構建與鑒定切膠回收陽性條帶，用DNA純化試劑盒純化，在T4 DNA連接酶作用下，將pMD 18-T simple vector與目的基因片段進行連接，轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌中，藍白斑篩選，按試劑盒說明提取質粒，酶切鑒定，測序得到pMDT-BDNF重組質粒。用BamH

8、Ⅰ、Hind Ⅲ分別雙酶切pMDT-BDNF質粒和逆轉錄病毒載體pLEGFP-N1，電泳線性片段并予以切膠回收、純化。 3．BDNF基因修飾神經干細胞的構建及表達復蘇逆轉錄病毒包裝細胞PT67，培養(yǎng)于含10％FBS的L-DMED培養(yǎng)基中，至細胞70％-80％匯片，脂質體Lipofectamine 2000介導pLEGFP-BDNF重組質粒轉染PT67細胞。轉染后48h，用含400ug/ml G418的L-DMEM進行篩選，1W后