蚓激酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、蚓激酶(lumbrokinase，LK)作為一種新型的溶栓藥物，正在廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療。目前臨床應(yīng)用的LK均是從蚯蚓體內(nèi)直接提取，其制備工藝繁雜，產(chǎn)量較低，因而通過(guò)基因工程手段生產(chǎn)大量高純度的LK已成為一種極有前景的途徑。本試驗(yàn)在之前工作基礎(chǔ)上構(gòu)建了含有蚓激酶基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，然后以牛體做為生物反應(yīng)器，在牛奶中瞬時(shí)表達(dá)蚓激酶，以期驗(yàn)證載體構(gòu)建的合理性，為最終獲得轉(zhuǎn)基因奶牛等乳腺生物反應(yīng)器提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、 首先將含有山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5’區(qū)調(diào)控序列(BCP)、蚓激酶基因(lumbrokinase)以及牛生長(zhǎng)激素基因polyA(BGHpolya)序列的表達(dá)盒克隆到骨架為Moloney小鼠白血病病毒(缺失基因組)、含有標(biāo)記基因Neo<'R>的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCL中，構(gòu)建了蚓激酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLN-BCP-LK<'R>。以生理鹽水為溶劑，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染泌乳期奶牛乳腺小葉，收集不同時(shí)段奶樣，采用纖維蛋白平板溶圈

3、法(Fibrin Agarose Plate Assay，F(xiàn)APA)檢測(cè)其纖溶活性，結(jié)果顯示，BCP作為乳腺特異性啟動(dòng)子能指導(dǎo)目的基因即蚓激酶基因在奶牛乳腺組織實(shí)現(xiàn)有效瞬時(shí)表達(dá)，并且根據(jù)FAPA法檢測(cè)結(jié)果表明奶牛乳腺組織在注射重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3h后，奶樣即出現(xiàn)明顯纖溶，6～16h纖溶活性達(dá)到最高，持續(xù)時(shí)間40～60h，有的甚至可達(dá)78h，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出最高表達(dá)量約為40000UK/L牛奶。 將表達(dá)目的蛋白的奶樣經(jīng)S