人cd59 rnai逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

1、<p>　　人CD59 RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定</p><p>　　作者：石學香 高美華 臧金林 </p><p>　　【摘要】 目的 利用siRNA表達載體法構(gòu)建并篩選攜帶針對CD59基因pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞克隆。方法 用DNA重組技術(shù)，將3條60 bp能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向CD59小發(fā)夾RNA（shRNA）的寡核苷酸序列

2、定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER retro，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細胞系Phoenix A，建立產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞克隆。結(jié)果 重組載體經(jīng)PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定初步成功后測序序列正確；重組載體轉(zhuǎn)染包裝細胞，可表達綠色熒光蛋白，表明包裝成功。結(jié)論 特異性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞系構(gòu)建成功，為后續(xù)進行腫瘤細胞的研究奠定了基礎(chǔ)，可望為腫瘤治療開辟新途徑。 </p>

3、<p>　　【關(guān)鍵詞】 RNA,雙鏈；抗原,CD59；轉(zhuǎn)染；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 </p><p>　　CD59是補體終末段的一種調(diào)節(jié)蛋白，具有抑制補體攻膜復合物的形成，保護細胞免遭補體介導的溶細胞作用。FONSATTI等[1]研究顯示，CD59與腫瘤的生長失控及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由于在大多數(shù)實體瘤細胞膜表面存在或者高表達CD59等一系列的膜補體調(diào)節(jié)蛋白，使得腫瘤細胞逃脫了自身的免疫監(jiān)視以及靶向單克隆抗體治

4、療中由補體介導的溶細胞作用，免疫逃逸是導致眾多腫瘤治療方案失敗的重要原因[2,3]。目前，在實體腫瘤的免疫治療研究中，一個更加有效的策略是使腫瘤細胞膜上的補體調(diào)節(jié)蛋白失活或不表達。本研究選擇CD59作為靶基因，應用RNA干涉（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建攜帶針對CD59的pSUPER retro neo+gfp重組載體，以特異性沉默腫瘤細胞中CD59基因表達，觀察小發(fā)夾RNA（shRNA）對靶基因表達的抑制作用，以及靶基因沉默對腫瘤細胞凋亡和增

5、殖的影響。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　　逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞Phoenix A及pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒均由我院羅兵教授惠贈，大腸桿菌JM109為本實驗室保存菌種，靶向CD59的60 bp oligos

6、由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；E.Z.N.A.Gel Extraction kit購自美國OMEGA公司。 </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 靶向CD59基因寡核苷酸的設(shè)計 應用美國Oligo Engine公司提供的雙鏈RNA（siRNA

7、）設(shè)計軟件，將CD59的基因序列號輸入后，通過Blast搜索確認與人的基因序列無同源性，選出3條序列（分別為218～236 bp，261～279 bp，318～336 bp）作為實驗組。按照pSUPER質(zhì)粒說明書中構(gòu)建發(fā)夾狀短鏈RNA的原則，設(shè)計序列分別為：T1組，5′GATCCCCGCGTGTCTCATTACCAAAGTTCAAGAGACTTTGGTAATGAGACACGCTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGCG

8、TGTCTCATTACCAAAGTCTCTTGAACTTTGGTAATGAGACACGCGGG3′；T2組，5′GATCCCCGTGTTGGAAGTTTGAGCATTTCAAGAGAATGCTCAAACTTCCAACACTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGTGTTGGAAGTTTGAGCATTCTCTTGAAATGCTCAAACTTCCAACACGGG3′；T3組，5′GATCCCCTGAGCTAA

9、CGTA</p><p>　　1.2.2 重組載體的構(gòu)建 本研究選用美國Oligo Engine公司的pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒作為載體，該載體有Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ兩個酶切位點，兩位點之間為長983 bp的填充序列，將該填充序列切下后，與上述合成的具有Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ黏性末端的60 nt的寡核苷酸雙鏈連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒。 </p><p>　　1.2.3

10、 重組載體的鑒定 PCR初步驗證重組載體的正確性，設(shè)計一對引物，擴增產(chǎn)物為包括插入序列及其兩側(cè)部分堿基的一段長度為395 bp的核苷酸，引物序列如下: pSUPERa:5′CCTTTATCCAGCCCTCACTC3′，pSUPERs:5′AGACTGCCTTGGGAAAAGCG3′。分別以重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59及空質(zhì)粒為模板進行PCR反應。陽性克隆可觀察到長為395 bp條帶，而空質(zhì)?？捎^察到長1 318 b

11、p條帶。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59以及對照空質(zhì)粒，37 ℃水浴過夜，次日各取10 μL于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。陽性克隆可觀察到長為281 bp條帶,而空質(zhì)?？捎^察到長為1 204 bp條帶。為進一步驗證插入序列的準確性，把堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA及過夜搖菌的產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。 </p><p>　　1.2.4 轉(zhuǎn)染包裝

12、細胞系Phoenix A 雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系Phoenix A，培養(yǎng)液為含體積分數(shù)0.10胎牛血清、105 U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM，于37 ℃，含體積分數(shù)0.05的CO2溫箱中培養(yǎng)。當細胞匯合度達80%～90%時，按說明書利用脂質(zhì)體Lipofectine 2000（Invitrogene）將重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59導入Phoenix A細胞，48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。 <

13、/p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果 </p><p>　　該質(zhì)粒全長8 371 bp，Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ兩酶切位點之間的序列長為983 bp，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ將質(zhì)粒雙酶切后，可觀察到長983 bp和7 388 b

14、p的DNA片段。 </p><p>　　2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 </p><p>　　取4 μL的PCR反應產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并取空質(zhì)粒為陰性對照。電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒可觀察到長395 bp的條帶，而空質(zhì)粒可觀察到長為1 318 bp的條帶。見圖1。 </p><p>　　2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 </p><p>　　選取

15、ALB平板上的可疑菌落搖菌后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，取10 μL酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并選取空質(zhì)粒作為對照。電泳結(jié)果顯示，空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒均觀察到長7 167 bp的DNA條帶，但空質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的較小的DNA片段長為1 204 bp，而重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59則長為281 bp。見圖2。 </p><p>　　2.4 靶序列鑒定 </p><p>　　重

16、組質(zhì)粒pSUPERsiCD59的測序結(jié)果與我們設(shè)計合成的T1、T2、T3、C組的序列完全一致，結(jié)果表明長60 bp的寡核苷酸插入pSUPER載體，靶向CD59基因的pSUPERsiCD59載體構(gòu)建成功。 </p><p>　　2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝 </p><p>　　重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細胞Phoenix A，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察

17、到綠色熒光，說明包裝出的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性。 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　CD59是近年來發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質(zhì)量為18 000～20 000的補體調(diào)節(jié)蛋白，其最重要的功能是通過阻止補體攻膜復合物(MAC)的裝配以保護宿主細胞免受補體溶破[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)實體瘤細胞膜表面存在或者高表達CD59 等一系列的

18、膜補體調(diào)節(jié)蛋白，提示CD59與腫瘤的失控性生長和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。目前，在實體腫瘤的免疫治療中，一個更加有效的策略是使腫瘤細胞膜上的補體調(diào)節(jié)蛋白失活或不表達。 </p><p>　　圖1 重組質(zhì)粒PCR反應產(chǎn)物鑒定電泳（略） </p><p>　　M:Maker DL2000;①～④:分別為重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59T1、T2、T3、C;⑤～⑥：空質(zhì)粒;⑦：陰性對照 </

19、p><p>　　圖2 EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒鑒定電泳 </p><p>　　M: Maker DL2000 ①、②:空質(zhì)粒;③～⑥:重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59T1、T2、T3、C </p><p>　　RNAi是自然界中普遍存在的一種重要的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。文獻報道，用人工合成19～23 nt siRNA直接轉(zhuǎn)染或shRNA經(jīng)載體介導后轉(zhuǎn)染

20、靶細胞可誘導RNAi，能產(chǎn)生對相應序列mRNA的特異性降解[5]。鑒于CD59基因的過度表達是腫瘤免疫逃逸導致眾多腫瘤治療方案失敗的重要原因，故可作為選擇性干預的靶基因。目前，制備siRNA的方法主要有兩類，即體外制備和體內(nèi)表達，兩者最大的不同在于前者直接作用于RNA，而后者的對象則是DNA。根據(jù)具體工具不同可進一步劃分為5種RNAi實驗方法，即化學合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、制備siRNA混合物、siRNA表達盒子和siRNA表達載體法。si

21、RNA表達載體法的特點是由RNA聚合酶啟動子（polⅢ）啟動體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，另外有4～5個T組成的轉(zhuǎn)錄終止位點，常用RNA聚合酶啟動子包括人和鼠的U6啟動子以及人H1啟動子等3種。選擇RNA polⅢ是因為它總是在離啟動子固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄，遇到4～5個連續(xù)的U即在轉(zhuǎn)錄終止位點的第2個堿基處終止，非常精確[6]。由于質(zhì)?？梢栽诩毎麅?nèi)復制擴增，這種帶有抗生素抗性標記的載體抑制基因，表達的效果可持續(xù)幾周甚至更長，這使之</p>

22、<p>　　本文用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建針對CD59的shRNA轉(zhuǎn)錄載體。攜帶靶序列pSUPERsiCD59載體是帶有新霉素抗性基因和綠色熒光蛋白編碼基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體帶有依賴RNA聚合酶Ⅲ的H1啟動子，可轉(zhuǎn)錄生成針對靶基因的shRNA，在體內(nèi)再加工生成雙鏈的小干涉RNA，進而降解相應的靶mRNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染分裂期細胞，使目的基因穩(wěn)定地整合到靶細胞基因組，能長期表達，而且不產(chǎn)生輔助病毒，具有很好的安全性[7

23、]。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雙嗜性包裝細胞Phoenix A，包裝成功的Phoenix A細胞在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功，獲得可以感染靶細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒能產(chǎn)生針對靶基因CD59的shRNA，使靶基因的mRNA降解，為更深入地探討CD59基因沉默對CD59陽性腫瘤細胞凋亡和增殖分化影響，進而為用于CD59相關(guān)腫瘤的治療奠定了實驗基礎(chǔ)。 </p><p><b>　　【參考文獻】

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