人肝細(xì)胞可回復(fù)永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的初步研究.pdf

1、背景和目的:肝細(xì)胞材料已成為限制生物人工肝(bioartificial liver, BAL)及肝細(xì)胞移植(hepatocytes transplantation, HTX)發(fā)展的瓶頸問題,這一問題的解決必將大大提升BAL及HTX的臨床實(shí)用價(jià)值.理論上講,人肝細(xì)胞(包括成人肝細(xì)胞及人胎肝細(xì)胞)最為理想,但成人供肝來源極其有限且僅用于肝移植,加之成人肝細(xì)胞在體外增殖能力差,故大量獲得成人肝細(xì)胞是不可能的.胎肝的利用因涉及倫理問題,亦難以推

2、廣應(yīng)用.使用動(dòng)物肝細(xì)胞又存在發(fā)生免疫反應(yīng)及傳播動(dòng)物病毒的危險(xiǎn).肝細(xì)胞株(如HepG2、C3A、HHY41、HepZ等)分化功能較原代肝細(xì)胞差,且多為瘤源性或由原代肝細(xì)胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染獲得,存在安全性問題.可回復(fù)性永生化程序?yàn)榻鉀Q細(xì)胞材料問題提供了新的思路及手段.其基本原理是先將永生化基因猿猴病毒40大T抗原基因(simian virus 40 large T antigen gene, SV40T)導(dǎo)入原代細(xì)胞以獲得永生化細(xì)胞株,使其獲得體

3、外增殖能力,然后再以特異性位點(diǎn)重組技術(shù)切除SV40T基因,使細(xì)胞株回復(fù)到永生化前的狀態(tài),這樣細(xì)胞既得到了增殖又不具有致癌性及病毒感染的可能性.根據(jù)這一原理,該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,旨在為人肝細(xì)胞的可回復(fù)永生化奠定基礎(chǔ).該研究共分三部分進(jìn)行:第一部分為菌落聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)篩選重組陽性克隆方法的建立,旨在為構(gòu)建載體的快速鑒定提供有效手段;第二部分為SV40T外顯子

4、的拼接和pLLTSN的構(gòu)建,旨在刪除其內(nèi)含子并縮短外源基因DNA的長(zhǎng)度,以利于后續(xù)基因的插入;第三部分為可回復(fù)永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIGlox的構(gòu)建,旨在為肝細(xì)胞的可回復(fù)永生化奠定基礎(chǔ).方法:1.采用合成的loxP正義單鏈為上游引物,載體互補(bǔ)的序列為下游引物并直接以菌落為模板進(jìn)行PCR對(duì)插入LoxP序列的重組陽性克隆進(jìn)行鑒定,并用酶切法鑒定loxP序列重組陽性克隆,兩者效果作對(duì)比分析.2.以質(zhì)粒 pUC19-SV40T為模板,高

5、保真PCR分別擴(kuò)增SV40T的兩個(gè)外顯子.3.重疊延伸拼接法(splicing by overlapping extention, SOE)連接SV40T的兩個(gè)外顯子,刪除其內(nèi)含子序列.4.將SOE拼接的SV40T定向克隆于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLLTSN.5.用菌落PCR和酶切分析篩選鑒定pLLTSN重組陽性克隆,并對(duì)pLLTSN載體上的2.1 kb SV40T進(jìn)行DNA測(cè)序

6、分析和互聯(lián)網(wǎng)比對(duì).6.以pLLTSN提供2.1 kb SV40T,插入pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)成的載體命名為pCTIG.7.用XhoⅠ和NotⅠ從pCTIG上切下SV40T-IRES-EGFP片段,連接到pLNCX2質(zhì)粒載體上相同的限制酶切位點(diǎn),構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIG.8.人工合成具有與XbaⅠ酶切末端相同4堿基粘端的loxP互補(bǔ)雙鏈,將其插入到pLNCTIG載體3'LTR的U3區(qū)XbaⅠ

7、位點(diǎn).結(jié)果:1.自身引物菌落PCR篩選出loxP小片段重組陽性克隆,而用酶切方法鑒定未能清楚顯示結(jié)果.2.成功拼接了SV40T兩個(gè)外顯子,刪除其內(nèi)含子序列,并獲得含2.1 kb SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLLTSN,DNA測(cè)序分析和互聯(lián)網(wǎng)比對(duì)顯示,所拼接2.1 kb SV40T為無內(nèi)含子的VA45-54-1株SV40T的編碼序列.3.通過菌落PCR和酶切分析篩選和鑒定,獲得了新霉素耐藥基因(neomycin resistance ge

8、ne, Neo<'r>)、SV40T和加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)共表達(dá)的真核表達(dá)載體pCTIG和永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIG.4.單酶切位點(diǎn)連接法于pLNCTIG的3'LTR插入loxP重組識(shí)別位點(diǎn),獲得了可回復(fù)永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIGlox.結(jié)論:1.該實(shí)驗(yàn)建立了高效、快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的自身引物菌落PCR方法,將酶切分析法中小片段大小的判斷標(biāo)準(zhǔn)

9、轉(zhuǎn)化為較大的PCR產(chǎn)物的有無,使重組陽性克隆的鑒別變得更為容易.成功地篩選出短片段loxP序列重組陽性克隆.2.通過基因的重疊延伸拼接法(SOE)成功拼接了SV40T基因的2個(gè)外顯子,獲得無內(nèi)含子的SV40T編碼序列DNA片段,并克隆于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上,同時(shí)構(gòu)建了含SV40T-IRES-EGFP雙順反子的真核表達(dá)載體pCTIG和pLNCTIG.3.于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIG的3'LTR的U3區(qū)插入Cre-loxP重組系統(tǒng)的特異性重組