骨骼肌特異性報(bào)告基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與驗(yàn)證.pdf

1、目的：衛(wèi)星細(xì)胞(muscle satellite cells)認(rèn)為是保留在成年骨骼肌內(nèi)具有增殖分化能力的肌源性細(xì)胞。建立簡(jiǎn)便快速的鑒定和篩選骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法對(duì)于衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)、研究和應(yīng)用都具有實(shí)際的意義。Desmin是目前知道的表達(dá)開始于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞并在肌纖維中高表達(dá)的標(biāo)志蛋白。因此以Desmin基因的啟動(dòng)子元件控制的報(bào)告基因可望建立鑒定和篩選骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)便方法。本課題目的是構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒報(bào)告基因載體，特異性表達(dá)于骨骼肌細(xì)胞中

2、，并通過檢測(cè)其綠色熒光蛋白表達(dá)，驗(yàn)證其在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)的特異性。并在此基礎(chǔ)上將本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建重組載體制備成逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液，檢測(cè)其在分化的P 19細(xì)胞中的表達(dá)。 方法：(1)重組載體的構(gòu)建與鑒定，首先用PCR法擴(kuò)增所需要的目的片段，綠色熒光蛋白和新霉素基因(GFP+NEO)和desmin啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(pro+enh)，然后利用限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，將目的基因連接到經(jīng)Nco Ⅰ，BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶

3、切后回收的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體psuper線性片段上。(2)重組載體的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)特異性驗(yàn)證：將psuper和重組載體分別轉(zhuǎn)染CHO和C2C12細(xì)胞，24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，采集圖片。(3)逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液制備及其在分化P19細(xì)胞中的應(yīng)用，逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液轉(zhuǎn)染C2C12和DMSO誘導(dǎo)分化的P19細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，采集圖片。 結(jié)果：(1)通過對(duì)構(gòu)建過程的每一步進(jìn)行電泳分析，證明了所

4、構(gòu)建重組載體是正確的。(2)重組載體和psuper轉(zhuǎn)染CHO和C2C12細(xì)胞后，在C2C12細(xì)胞表達(dá)水平相當(dāng)，說明重組載體在C2C12中能夠表達(dá)，而在CHO細(xì)胞中重組載體看不到表達(dá)，psuper則具有很高的表達(dá)。這就說明了重組載體具有骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)特異性。(3)制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液轉(zhuǎn)染C2C12后，綠色熒光表達(dá)效率有所提高但是并不非常明顯。在轉(zhuǎn)染了誘導(dǎo)分化的P19細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的表達(dá)，據(jù)此可以定性判斷DMSO誘導(dǎo)P19細(xì)