基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的表達(dá)克隆法的建立.pdf

1、21世紀(jì)初，在人類基因組序列完成之后，對基因功能的研究顯得日益重要，發(fā)現(xiàn)基因的受體將對了解基因的功能和作用機(jī)理起到至關(guān)重要的作用。與目前常規(guī)應(yīng)用的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型不同，本研究從尋找基因受體入手從而開啟研究新基因功能的大門。配體/受體可在體內(nèi)外相互作用，雖然配體/受體的親和力不同，但大多數(shù)情況下配體/受體反應(yīng)可在體外通過標(biāo)記配體或受體而檢測出來。
　　 本研究建立的高通量表達(dá)克隆系統(tǒng)（expression cloning sys

2、tem）是一種快速、靈敏、高通量的篩選系統(tǒng)，它可用于分離、篩選受體和膜結(jié)合配體，該系統(tǒng)是以高效表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為核心，以高通量的磁力篩選法（Magnetic Cell Sorter，MACS）和高精密度的流式細(xì)胞儀分選法（Fluorescence-Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS）相結(jié)合的獨(dú)特的篩選方法。主要依據(jù)是配體/受體的相互結(jié)合，然后通過磁力分離和流式細(xì)胞儀分選將陽性細(xì)胞從眾多的陰性細(xì)胞中分離出來，再從擴(kuò)增

3、的陽性細(xì)胞中分離和鑒定受體基因。
　　 具體方法是將已知的配體經(jīng)Fc標(biāo)記后作為誘餌，再與ProteinG標(biāo)記的磁珠結(jié)合，磁珠的特點(diǎn)是非常微小，相當(dāng)于一個(gè)病毒顆粒，當(dāng)配體蛋白結(jié)合到宿主細(xì)胞表面表達(dá)的受體上時(shí)，該細(xì)胞將停留在磁場中，從而與非受體表達(dá)細(xì)胞分開。MACS的優(yōu)點(diǎn)是效率高，可同時(shí)操作上億細(xì)胞，如此大量的細(xì)胞是無法直接在分選型流式細(xì)胞儀上操作的，所以經(jīng)MACS篩選到的陽性細(xì)胞增殖后，再次用同一配體孵育，用更精確的流式細(xì)胞儀分選

4、，直至完全純化，受體基因?qū)⒂门c載體互補(bǔ)的引物，經(jīng)PCR方法克隆。
　　 利用該系統(tǒng)具有很好的靈敏度，可以從106個(gè)細(xì)胞中篩選出低至2個(gè)表達(dá)受體的陽性細(xì)胞。為驗(yàn)證該系統(tǒng)的可行性，應(yīng)用該系統(tǒng)在相應(yīng)的cDNA文庫中篩選到了2個(gè)已知基因的細(xì)胞受體；應(yīng)用配體B7-H2蛋白作為誘餌，從活化的人T淋巴細(xì)胞cDNA文庫中篩選到其受體ICOS（inducible CO-stimulator），最終，從純化的受體表達(dá)細(xì)胞中分離出受體基因；應(yīng)用配體B