逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的端粒酶抑制基因促進肝癌細胞凋亡的研究.pdf

1、本研究運用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，將端粒酶抑制基因?qū)敫伟┘毎?，從而使肝癌細胞生長受到抑制，細胞凋亡增多，為肝癌基因治療提供新途徑。 方法：使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體pLXSN構(gòu)建的真核表達重組質(zhì)粒pLXSN-hTR，攜帶反義端粒酶RNA基因，將其用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317細胞及PT67細胞，G418篩選抗性細胞，獲取陽性細胞克隆株，即穩(wěn)定表達病毒的產(chǎn)病毒細胞株，收集培養(yǎng)上清液中的重組病毒，用NIH3T3細胞測定病毒滴度。將獲

2、得的重組病毒離心濃縮后直接感染人肝癌細胞系Bel7402，PCR檢測目的基因的插入，端粒酶反義RNA組分整合入肝癌細胞基因組中，通過其在細胞內(nèi)的表達抑制肝癌細胞端粒酶的活性，從而抑制肝癌細胞的生長，并促進癌細胞凋亡。我們通過細胞生長曲線和MTT法檢測細胞生長抑制率。這為以后的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在體內(nèi)感染腫瘤細胞，從而使腫瘤的基因治療成為可能。 結(jié)果：使用構(gòu)建成功的逆轉(zhuǎn)錄病毒真核重組質(zhì)粒pLXSN-hTR，將其用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染包裝細

3、胞PA317細胞及PT67細胞，轉(zhuǎn)染效率可達27.2％和33.6％，G418篩選抗性細胞，獲取陽性細胞克隆株，即穩(wěn)定表達病毒的產(chǎn)病毒細胞株，收集培養(yǎng)上清液中的重組病毒，用NIH3T3細胞測定病毒滴度，正義病毒和反義病毒滴度分別為2.7x105cfu/ml和3.9x105cfu/ml。將獲得的重組病毒直接感染人肝癌細胞系Bel7402，PCR檢測感染成功，端粒酶反義RNA組分整合入肝癌細胞基因組中，通過其在細胞內(nèi)的表達抑制肝癌細胞端粒酶的

4、活性，從而抑制肝癌細胞的生長，并促進肝癌細胞凋亡。細胞生長曲線和MTT法檢測細胞生長抑制率，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。倒置相差顯微鏡下亦可見細胞凋亡增多。 結(jié)論：逆轉(zhuǎn)錄病毒只感染生長性細胞，特別是生長旺盛的癌細胞，使其治療具有一定的靶向性，很大程度上避免了外源基因?qū)φ＝M織的損傷，并可持續(xù)表達，無需反復(fù)應(yīng)用，是一種優(yōu)秀的基因轉(zhuǎn)染工具。電穿孔法將其導(dǎo)入肝癌細胞，轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單快捷，DNA的片段不需要特殊的純化處理，逐步顯示出