逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的反義端粒酶RNA基因誘導肝癌凋亡機制的研究.pdf

1、目的：研究逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘毎闎el—7402凋亡相關分子的影響。從凋亡相關基因的角度研究反義端粒酶基因誘導肝癌細胞株凋亡的作用機制。觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘毎曜饔玫拈L期效應。 方法：本課題組前期研究成功利用用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXSN構(gòu)建攜帶正義和反義端粒酶RNA基因真核表達載體，進行質(zhì)粒擴增、提取，電穿孔法將攜帶正義和反義端粒酶RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達載體質(zhì)粒導入PT

2、67包裝細胞，篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒細胞株，分別命名為PT67—hTR—EcoRI和PT67—hTR—BamHI；收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，超速離心獲得濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用NIH3T3細胞檢測所收集逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度；感染肝癌細胞株BEL—7402，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞克隆，分別命名為BEL—7402—hTR—EcoRI和Bel—7402—hTR—BamHI；挑取單個細胞克隆擴增培養(yǎng)，利用擴增端粒酶RNA基因的引物進行PCR鑒定；TR

3、AP—PCR—ELISA法檢測端粒酶活性，流式細胞術（FCM）檢測細胞凋亡與細胞周期，Hochest33258標記熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡，Annexin V—PI（碘化丙錠）雙染FCM分析細胞凋亡。Western Blot檢測P53、Bax、Bcl—2蛋白表達水平變化，以β—actin作為內(nèi)參照。 結(jié)果：PCR鑒定可于約500bp處檢測到目的基因的表達，證明基因轉(zhuǎn)染成功；流式細胞術檢測結(jié)果示試驗組Bel—7402—hTR—Ba

4、mHI細胞的凋亡率為（19．0±2．06）％，與對照組相比差別具有顯著性（P<0．01），且試驗組肝癌細胞可見G2/M期阻滯及凋亡峰。Hochest33258染色顯示Bel—7402—hTR—BamHI細胞凋亡增加。Western Blot檢測到P53、Bcl—2蛋白表達水平上調(diào)，Bax表達水平下調(diào)。 結(jié)論：端粒酶RNA（hTR）是端粒酶活性的一個重要組成部分，本研究數(shù)據(jù)顯示通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的反義端粒酶RNA基因能夠抑制肝癌細